甘蓝型油菜小孢子诱导胚冷击、干燥和去子叶处理提高植株再生率研究.pdfVIP

甘蓝型油菜小孢子诱导胚冷击、干燥与去子叶 处理提高植株再生率研究’ 张国庆“许玲周伟军 浙江大学农业与生物技术学院农学系，杭州 310029 油菜在世界油料作物中占有重要地位。在常规育种过程中，甘蓝型油菜多通过花蕾杂 交与套袋自交以产生纯系，既费时又费力、影响了育种进程。自从1982年Lichter首次报道 油菜小孢子培养成功之后，在此方面的研究取得很大的进展，并将此项技术应用于产生单倍 体和双单倍体(DH)植株，加速了育种进程，节约劳力和时间，并提高了选择效率。试验发现 有很多因素影响小孢子胚分化，其中包括培养基的成分，供体植株的生长条件，基因型和小 孢子的发育阶段等。 小孢子出胚后植株的形成也受很多因素的影响。研究表明，基因型影响植株的再生，其 百分率达9．5％～37．5％。另外，培养基成分对植株再生也很重要，试验发现在NLN和B5 B5培养基 培养基中培养，植株再生率分别为9％和1％。也有一些研究表明1／2MS或1／2 比Ms或B5培养基效果要好。此外，胚大小也会影响植株再生。试验表明，冷击处理胚状 体能够增加植株的再生频率。本试验在先前研究基础上，探讨了冷击处理，胚干燥以及胚子 叶切除对甘蓝型油菜植株再生率的影响，以期建立一个高效的胚分化与植株再生的小孢子 培养体系。 1材料与方法 1．1供试材料与生长条件 试验以5个小孢子出胚较好的甘蓝弛油菜为试验材料。2002年10月份播种于浙江大 学华家池校区试验田，营养充足、管理精良。在进行小孢子培养前14天将植株移人温度可 控的温室中，温度控制在10—15℃。在早晨7：00—10：00取处于单核晚期的花蕾进行小孢 子培养。 1．2小孢子分离与培养 上取12个处于单核晚期的花蕾，用3．6％的次氯酸钠浸泡20分钟，然后用无菌水冲洗3次。 将无菌花营置于小烧杯，倒人冷的B5}13培养基，用玻棒将花葺轻轻捣碎，然后用40／xm尼龙 网将其过滤于离心管中。转速750rpm离心5分钟，离心两次。倒出_上请夜，然后倒入NLN。 ¨作者简介：张国庆(1978．)，男，山东泰安人．博士生．从事油菜育种与生理调控研究。周伟军教授为通讯作者，Tel edu．an 057lE-mail：qzbou@iu 286 食物与能源安全战略中的中国油料 13溶液48ml，并加入2％的活性炭少许，用移液枪将混匀的小孢子溶液分装于12个60mm× 7天，之后移入 15ram的培养皿中，最后用双层Parafilm密封。在黑暗培养箱中热击30。C 24℃黑暗继续培养，直到可见胚出现。 1．3胚状体处理与植株再生 培养基筛选：选取处于子叶期初期的胚，将其转移到5种培养基(以1／2MS为基本培养 MS+ 基，加入不同含量与组合的NAA，BAP和GA，)中进行培养，即A：1／2MS；B：1／2 0．2rag／1BAP；C：1／2MS+0．1,,lg／lGA3；D：1／2MS+0．2mg／lBAP+0．2rag／]NAA；E：1／2 MS+2BAP)。 Omg／l 冷击处理：胚冷击试验中，将子叶期胚移人诱导培养基，并置于4eC培养箱中，分别冷击 0、3、5和7天。然后转移到24℃、光照16小时的培养室中继续培养。并统计每处理的植株 再生率。 胚于燥：胚干燥试验中，选取健壮且大的子叶期胚，将其在无菌条件下转移到含有无菌 上继续培养。并统计植株再生率。 胚子叶切除：选取处于子叶期晚期的大胚进行子叶切除试验。在操作台上将胚的子叶 切除(但胚顶端的生长点及伸长的胚轴等均保留，见图2A)，一种处理为切除两片子叶的1／2 (一1／2)，另一种处理将两片子叶全部切除(一1／1)，后移人诱导培养基中继续培养。并统计 植株再生率。 1．4数据分析 小孢子分离后四个星期和胚接种于诱导培养基后一个月对各品种的胚萌发数和再生植 株数进行统计，得到的数据用SPSS