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固定化腈水合酶钓研究 姜少毕谢克昌 (太原理工大学烘科学技术教育部山西省重点实验室，山西太原．03(iff)．A) 黎刚 (胜利油田长安实业集团聚合物总厂，山东东营，257000) 摘要：本文主要是以一种能够产生腈水合酶的LL一1型诺卡氏红球菌为研究对象，针对 原来的海藻酸盐包埋法存在的固定化细胞强度较小、通透性较差等问题，对其加以改进，并对 固定化细胞的催化特性进行了研究。 关键词：腈水合酶催化特性 J 前言 丙烯酰胺是一种重要的精细化工产品，除日本外，直接使用它的国家不多，其中90％ 以上的丙烯酰胺都用于生产丙烯酰胺衍生物的均聚物和共聚物。特别是PAN产品，它广泛 应用于造纸、废水处理、固液分离、石油开采等领域。目前，工业上用丙烯腈水合生产丙烯 酰胺的主要工艺方法有三种：硫酸水合法、铜化合物催化水合法¨．2J和微生物催化水合法。 其中硫酸水合法因其投资大，AN单耗高，副产物(NH4)2S04多，环境污染大等诸多缺点， 现已逐渐被淘汰。铜化合物催化水合法虽然转化率有所提高，但是仍存在能耗大，催化剂调 制复杂，反应温度高及产品分离精制困难等许多问题。因此从20世纪70年代开始，许多先 进的工业化国家便积极着手于对转化腈类的菌种或生物酶制剂E3-61以及菌类细胞固定化的研 究【7,8j。特别是日本日东化成工业公司经过10年的努力，于1985年在横滨建立了年产4000 吨的丙烯酰胺装置。由于微生物法生产丙烯酰胺具有能耗低、副产物少、单体活性好，产品 易于精制等优点，这种生产工艺越来越受到人们的青睐。 本文主要是以一种能够产生腈水合酶的LL一1型诺卡氏红球菌为研究对象，针对原来的 海藻酸盐包埋法存在的固定化细胞强度较小、通透性较差等问题，对其加以改进，并对固定 化细胞的催化特性进行了研究。 2材料和方法 (t)菌种及试剂：LL一1型诺卡氏红球菌、海藻酸盐、氯化钙、活性炭(椰壳型Jtf一1， 山楂核型Jn一2)、丙烯腈、4N盐酸溶液 (2)仪器：1790气相色谱、超级恒温水浴 (3)测定方法： a)游离酶活力的测定：移取1mL菌体溶渡至三角瓶中，稀释二十倍(即移取19mLo．025 磷酸缓冲液)后，置于28．0。28．5的振动式恒温水浴槽中，待温度恒定后用以移液管移取 100mL的丙烯腈，迅速加入锥形瓶中，同时计时。反应5min后，立即加入3mL4N盐酸溶液 ·1624· 中止反应，用色谱法测定游离酶活力。 b)固定化酶活力的测定：移取5mL菌体溶液进行固定化，得到固定化细胞，然后移至 三角瓶中，稀释20倍后，置于28．0—28．5的振动式恒温水浴槽中，待温度恒定后用以移液 4N 管移取500毫升的丙烯腈，迅速加入锥形瓶中，同时计时。反应5mL后，立即加入15mL 盐酸溶液中止反应，用色谱法测定游离酶活力。 (4)酶活定义：每小时丙烯腈在水合酶的作用下生成ling丙烯酰胺所需的酶量为一个活 力单位。(单位：万U／hr) 相对活力：以游离酶活力为100％，同样蛋白量的酶联在固相载体后所显示的活力百 分数 即：活力回收％=(固定化酶制品酶活力单位总数／投入液酶活力单位总数)*100％ (5)固定化细胞的制备方法： a)原来的方法：先用离心法得到生物细胞，然后将细胞溶于一定量的蒸馏水中，再与 海藻酸盐混匀，并通过针管滴入氯化钙溶液中，得到圆球状颗粒。 b)预计改进方案：将生物细胞溶液与一定量的海藻酸盐、活性炭、抗坏血酸钠混合均 匀，并用针管将其滴人0P乳化剂和2％氯化钙溶液中，得到球状颗粒，固定化一定时间后， 滤出，加入戊二醛溶液中，充分振荡均匀，交联?h左右．最后得到固定化催化剂。 3结果与讨论 3．1固定化方法和条件的确定： 3．1．1戊二醛浓度的影响 戊二醛是一种交联剂，其交联机理如下： CH(CH2)3一cH=N一配基 R—NH2+CHO(CH2)3CHO+H2N一配基÷R…N 戊二醛能使酶蛋白分子间产生交联作用，凝