生物工业分析 教学课件 作者 罗建成 主编 李晓华 主审 第六章.pptVIP

尚辅网 尚辅网 尚辅网 色层分析法 　　（2）点样 　　取一张19×23厘米新华滤纸1号，在右下角距两底边各2厘米交点处理用毛细管点上样品溶液，见图5-23，点的直径应小于0.5厘米，共点5-8次。 另取一张19×23厘米新华滤纸1号，按上法用毛细管点上各种标准氨基酸溶液，每种氨基酸各点二次。此滤纸用作标准氨基酸的双向层析图谱。 尚辅网 色层分析法 　　（3）展开 　　将点样后的两边滤纸在相同的操作条件下，用上升法进行双向展开。 　　①酸向展开：以滤纸19厘米长的一边为高，用线缝成圆筒形（注意，纸的两边不相碰），放在盛有酸向展开剂的层析缸内饱和约1小时，然后将滤纸有样品的一端放入展开剂中，待溶剂前沿上升至距顶端约0.5厘米处时取出，吹干至无正丁醇味为止。 　　②碱向展开：将酸向展开后的滤纸在溶剂前沿的一端切去约1厘米，把滤纸转90°，以23厘米长的一边为高，用线缝成圆筒形，放入盛有碱向展开剂的层析缸中，并以12%氨水作为平衡溶剂，饱和约1小时，然后将滤纸放入展开剂中展开，待溶剂前沿到达滤纸顶端约0.5厘米处时，取出吹干。以同样条件碱向再展开一次，吹干。 尚辅网 色层分析法 　　（4）显色 　　将吲哚醌显色剂喷射整张滤张，吹干至乙酸味不太重时，放入100℃烘箱中5-10分钟，取了。将滤纸放入盛有吲哚醌底色褪色剂的搪瓷盘中褪去底色，此时各种氨基酸呈现不同的颜色。再将滤纸用自来水冲洗，立即用铅笔将斑点圈出。 　　4.氨基酸的定性鉴定 　　以样品的层析图谱与标准氨基酸的层析图谱相比较，根据斑点的位置与颜色鉴定啤酒中所含氨基酸的种类。 尚辅网 色层分析法 　　5.讨论 　　①吲哚醌显色剂与氨基酸所生成的颜色和显色剂的配制方法有关，因此必须使用同一次配制的显色剂进行显色。此外，同一氨基酸在不同pH值下所显的颜色也有差异，因此必须除尽滤纸上的展开剂后才能显色。 　　②为了确定各种氨基酸在双向层析图谱上的位置，可以将各种不同氨基酸，按上述同样的操作条件，分别在酸向展开剂与碱向展开剂中进行单向上升法展开，分别求出它们在两向中的Rf值，然后以所求得的Rf值以及斑点颜色来确定各种标准氨基酸在双向图谱上的位置。 尚辅网 色层分析法 　　③本法所用的展开剂对于丝氨酸与甘氨酸，缬氨酸与蛋氨酸不易被完全分开，但可以根据它们的Rf值与斑点颜色的不同来辩认。如果将纸上层析与纸上电泳合并使用（称电泳层析法），就可以完全分离清楚。 　　④由于各种氨基酸在本实验所用的碱向展开剂中的Rf值较小，故需展开二次。如用含酚或吡啶的溶剂系统来展开时只需一次，但酚与吡啶必须经蒸馏纯化后才能使用，且酚展开时速度较慢。 尚辅网 色层分析法 　　五、酿造酒中黄曲霉毒素的测定 　　1.原理 　　黄曲霉毒素B1在紫外线（365纳米）照射下能产生蓝紫色荧光，根据在薄层上显荧光的最低检出量与标准样对照，进行定性及半定量的测定。 　　2.试剂与仪器 　　⑴乙醚 　　⑵丙酮 　　⑶氯仿 　　⑷苯 　　⑸乙腈 　　⑹乙烷 　　⑺无水硫酸钠 尚辅网 色层分析法 　　⑻硅胶G 　　⑼安替福民（5%氯酸钠溶液）（试剂6-27） 　　⑽三氯乙酸 　　⑾黄曲霉毒素B1标准贮备液（10微克/毫升）（试剂6-28） 　　黄曲霉毒素B1Ⅰ号标准液（0.5微克/毫升）（试剂6-29） 　　黄曲霉毒素B1Ⅱ号标准液（0.2微克/毫升）（试剂6-30） 　　黄曲霉毒素B1Ⅲ号标准液（0.04微克/毫升）（试剂6-31） 　　⑿层析缸（内径25×6×4厘米） 　　⒀微量注射器（10微升，50微升） 　　⒁玻璃板（5×20厘米） 　　⒂薄层涂布器 　　⒃80-100瓦高压汞灯（附365纳米滤色片） 尚辅网 色层分析法 　　3.操作步骤 　　（1）样品处理 　　吸取酒样10毫升分洲漏斗中，加入足量的甲醇（根据样品的酒度，使醇——甲醇和乙醇与水约为6:4。如样品中含酒精量为20%，则需加甲醇10毫升）和20毫升氯仿，用力振摇抽提2分钟。静置，待分层后，将下层（氯仿层）通过装有10克无水硫酸钠的小漏斗流入蒸发皿中，再用10毫升氯仿重复抽提，用少量氯仿冲洗无水硫酸钠，净氯仿合并于蒸发皿中，于65℃水浴上挥发至干。用2.5毫升苯:乙腈=98:2溶剂溶解残渣，并用滴管迅速移至带塞小瓶中备用。 尚辅网 色层分析法 　　（2）硅胶G薄层板的制备 　　称取硅胶G20克于小研钵中，加约50毫升水（加水比一般为1:2-2.5，视硅胶G的性能及气候略有变动），用力研磨1-2分钟，搅成糊状后立即涂板，厚度约0.3-0.5厘米，然后用手轻轻敲动玻璃板，使硅胶分布均匀，放在水平的板上自然干燥数分钟。薄层固化后，于100℃干燥箱中烘2小时进行活化，活化后的薄层板平放于带有支架的干燥器中保存设备。 尚辅网 色层分析法 　　（3