Apoptin与hIL-18基因对人结肠癌细胞的作用研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第t次学术研讨会论文集 i I k-I Apoptn与h 8基因对人结肠癌细胞的作用研究7 连海，金宁一，米志强，李霄，解丽华，徐敬龙，金洪涛，李萍 (解放军军需大学，解放军基因工程重点实验室，长春，130062) anemia 鸡贫血病毒(Chicken 身免疫病、变态反应性疾病的发生。为了研究鸡贫血病毒VP3基因与hIL—18，基因的协同抗肿瘤作用， 进行了以下实验。 1、材料与方法 1．1主要材料与试剂 1由本室保存； Invitrogen公司；pIRES (2)细胞系：Hela细胞与人结肠癌细胞HCT一116由本室传代并保存； Reagant) 购自美国GIBCO公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。 1．2方法 pWP31L一18。质粒的大量提取与纯化等均按常规方法进行。 (2)体内重组：重组质粒用脂质体法转染Hela细胞，即于60 1X10s_2X RPMI RPMI 105／ml，在500ul1640中，加入10ulDoTAP，轻轻混匀，另取500ul 30min。将上述混匀液加入Hela细胞中共转染。 (3)间接免疫荧光鉴定：取适量的转染细胞，接种于玻片上，同时用正常细胞做对照，待凉干后，用 PBS(PH7．2)洗1次，用10％丙酮固定10—15 5次，将载有细胞的玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。 (4)重组质粒转染HCT一116细胞：按方法(2)操作。 (5)AO／EB染色检测细胞凋亡：用lul AO／EB溶液(1份PBS中100ug／mlAO溶液，1份PBS 中100ug／ml EB溶液)孵育25ui悬浮细胞(0．5x 7基金项目：国家“973”资助项目(G19990i1902) 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 细胞于载玻片上，加盖玻片，用装有荧光滤光片的荧光显微镜检测至少300个细胞。 (6)转染细胞超微结构分析：5000rpm15min离心收集细胞，加入冷的2．5％戊二醛固定液4℃固定。 常规包埋切片，醋酸铀与枸橼酸铅双重染色，电镜观察。 (7)统计学处理：统计学处理采用t检验。 2、实验结果 363bp的带切出，表明有插入片段。 光(图1 光，呈阴性反应【图1A)。 图1转染细胞免疫荧光检测hIL一18蛋白的表达 ImmunofluorescencedetectionofhIL一18 Fig．1 expression A：pVAXl；B：pWP31L一18 2．3重组质粒转染HCT一1 16细胞，在 倒置显微镜下观察，结果表明：pVVP3转染后48h肿瘤细胞部分脱落，死亡(图2 转染后48h肿瘤细胞大部分脱落，死亡(图2 i16的作用可能比pVVP3更强。 16后的细胞形态 图2 pVVP3和pWP31L一18转染HCT一1 TheformsofHCT一116cellstransiectedwith Fig．2 DWP3and PWP3IL一18 A：NormalHCT一116