表达新城疫病毒HN基因重组禽腺病毒的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集(2006年广州) 表达新城疫病毒斟基因重组禽腺病毒的研究’ 李刚① 张锦秀① 朱鸿飞① BerhaneY曲annes②BeataStachowiack② (①中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京，100081) (②加拿大奎尔夫大学安大略兽医学院，奎尔夫，N1G2W1) 摘要利用同源重组的方法成功构建了一株表达新城疫病毒HN基因的重组禽腺病毒(rFAdV-HN)。 用rFAdV-HN重组病毒感染CH．SAH细胞。运用Northernblot分子杂交及RT-PCR方法在感染12h 后可检出HN信使RNA(mRNA)，运用放射免疫沉淀方法在感染24h时可检出HN蛋白。 关键词重组禽腺病毒新城疫病毒HN基因 新城疫病毒(Newcastledisease virus。NDV))能够引起禽类急性、高度接触性、致死性传染病， 被国际兽疫局(OIE)列为对禽危害最大的A类传染病之一。新城疫病毒感染的宿主主要包括鸡、 野鸡、火鸡、鸭、鹅以及其它家养和野生的禽类，是一种可以广泛传播、对养禽业具有很大破坏性 凝素．神经氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L)在内的入种结构蛋白组成，HN在介导病毒与宿主细胞 上病毒受体的结合起着重要的作用，同时它也参与了被感染细胞与其它细胞的相互粘合，因此，HN 基因是机体产生对NDV免疫应答的重要基因之一。 禽腺病毒可以作为口服疫苗的载体，并且可以诱导黏膜免疫。在本研究中，我们构建表达新城 疫病毒HN基因的重组禽腺病毒，使其在内源性病毒FAdV-9的主要晚期启动子的控制下表达NDV 疫苗。 1．材料和方法 1．1材料构建重组病毒所需的质粒、细胞由加拿大奎尔夫大学安大略兽医学院Dr．EvaNagy及 Davor ojikie提供。 1．2方法 1．2．1克隆及同源重组 ． 将获得的HN 化，与FAdV-9病毒DNA共转化到BJ5138 pFAdV-HN，将得到的线性FAdV-HN用脂质体方法转染入CH．SAH细胞。(图1) 加拿大国家自然科学基金(NSERC)项目、兽医科学博士基金(DVSc)项目 李刚(1958·)男，教授，博导．研究方向：动物传染病防制．Email：gli358@gamil．com 552 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集(2006年广州) 图l 重组禽腺病毒(FAdV．HN)的构建示意图 1．2．2限制性内切酶多态性分析(RFLP) 用这三种限制性内切酶对FAdV-9以及rFAdV-HN酶切，以进行多态性的分析。(如图2所示) ． 1．2．3Southernblot分子杂交 。， eDNA作为探针，以FAdV为对照，证实 使用含有异羟洋地黄毒苷配基(digoxigenin)的HN rFAdV．HN中是否存在HN基因。(如图3所示) 1．2．4DNA测序 ’ 。 1．2．5聚合酶链式反应(PCR) 通过在HN基因上设计上游引物，下游引物，证实在培养五代过后rFAdV．HN中HN基因是否能 够保持稳定。(如图4所示) 1．2．6反转录聚合酶链式反应(RT．PCR) 计引物，对不同时期HN基因的表达状况进行分析。(如图5所示) 1．2．7Northem blot分子杂交 使用含有异羟洋地黄毒苷配基(digoxigenin)的HN 在12小时与24小时后的RNA表达水平。(如图6所示) 1．2．8放射免疫沉淀 2．结果 2．1限制性内切酶多态性分