多酚氧化酶活性的测定.pptVIP

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2017-08-18 发布于重庆
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多酚氧化酶活性的测定.ppt

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多酚氧化酶活性的测定.ppt

实验多酚氧化酶活性的测定一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解诸如：果实受伤、组织变褐的原因等。二、原理与方法多酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。三、仪器与试剂0.5%邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0、试管、恒温水浴、分光光度计等四、实验方法： 1.设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测定。 2.酶液的制备：称取样品5.0g，用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容至100ml，在18-20℃下浸提30分钟，中间摇动数次，过滤备用。 3.测定：（1）对照：在含有6mlpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1ml0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1ml灭酶后的酶液，2ml蒸馏水，以此调零。（2）样品测定：在含有6mlpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1ml0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1ml酶液，反应5分钟，加热灭酶以终止反应，以5000r/min离心10分钟，取上清液备用。在410nm下测定吸光度。五、实验结果记录：以每分钟A410变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位（u） * * 式中：A410：反应时间内吸光度的变化， W：样品鲜重g， t：反应时间min， VT：提取酶液总体积ml， Vs：测定时取用酶液体积ml。 *