动物免疫学实验指导.doc

动物免疫学实验指导 第二版 徐春厚 谢为天 雍艳红 编 动物医学 生物技术专业用 广东海洋大学教材科出版 二00七年二月二十八日 目 录 实验一 凝集试验………………………………………………………1 实验二 沉淀试验………………………………………………………4 实验三 溶血试验………………………………………………………8 实验四 病毒的血凝及血凝抑制试验 ………………………………10 实验五 E-玫瑰花环试验 ……………………………………………13 实验六 EA玫瑰花环试验 ……………………………………………15 实验七 EAC玫瑰花环试验……………………………………………17 实验八 酶联免疫吸附试验 …………………………………………18 实验九 荧光抗体技术 ………………………………………………20 实验十 多克隆抗体（免疫血清）的制备 …………………………22 实验一 凝集试验 颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen）（Agglutinin）2.3 0.5 0.5 0.5 0.5 被检血清 0.2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 抗原(1：20) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃1.5 弃0.5 5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。 6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。 ＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。 ＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。 ＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。 ＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。 －：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。 7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。 牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。 [注意事项] 1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。 2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。 （二）布氏杆菌病平板凝集试验 1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100(L微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80(L、第2格40(L、第3格20(L、第4格10(L。血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tip头。 大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40(L 和20(L ；猪、山羊、绵羊、狗用80(L和40(L。 2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30(L，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。 抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。 3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。 4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。 5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。 ＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。 ＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。 ＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。 ＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。 －：液体均匀混浊，无凝集现象。 6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。 表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系 平 板