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胃癌细胞系MKN 中HLA_医学论文 胃癌细胞系MKN 中HLA_医学论文 作者：沈宇清,张建琼,夏梅,缪凤琴,单祥年,谢维 ［摘要］目的:探讨胃癌细胞系MKN中HLAⅠ类抗原表达水平异常的分子机制。方法：以胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901为对照，利用流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类复合物的表达情况，Western blot检测HLAⅠ类分子重链及轻链表达情况，半定量RTPCR检测HLAⅠ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况，并利用HLA基因区域的微卫星序列检测MKN细胞HLA基因在DNA水平的完整性。结果：胃癌细胞系MKN表面HLAⅠ类复合物表达降低，重链A及B/C位点蛋白无表达而轻链表达无异常。在mRNA水平，胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失。微卫星DNA扩增结果初步显示，MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失。结论：胃癌细胞系MKN HLAⅠ类分子复合物表达降低可能是由HLAⅠ类分子重链及其加工分子在转录水平改变而引起的。 　　［关键词］胃癌；HLAⅠ类分子；微卫星序列 　　在许多人类肿瘤中发现人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ类分子的表达下调和丢失，这是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的重要途径之一，也是临床T细胞依赖性免疫治疗的关键障碍［1］。HLAⅠ类分子抗原加工途径中的任何缺陷均可导致细胞表面HLAⅠ类分子―抗原肽复合物表达缺陷［2］。我们已证实胃癌组织标本有明显的HLAⅠ类分子表达下调或缺失，说明胃癌是一类免疫原性较弱的肿瘤［3］。为进一步探讨其机制，作者研究了4株胃癌细胞系HLAⅠ类及其相关分子的表达情况，寻找导致表达下调和丢失的具体原因。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 肿瘤细胞系 胃癌细胞系BGC823、MGC803购自中国科学院上海细胞研究所，胃癌细胞系SGC7901、MKN由东南大学生物科学与医学工程系惠赠。 　　1.1.2 抗体 流式细胞检测所用PE标记的鼠抗人HLAABC抗体(PHARMINGEN) 购自晶美公司。Western blot所用鼠单抗为美国Soldano Ferrone博士（Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY ,USA）惠赠。其中HC10 (抗HLAB，C重链)和HCA2（抗HLAA重链）的工作浓度均为1∶1 000，L368（抗HLA轻链）的工作浓度为1∶500。内参单克隆抗体antiβactin（Sigma）和HRP标记的羊抗鼠二抗（Sigma）均购自南京生工公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 流式细胞仪检测 取106个细胞，PBS洗涤2次，加入20μl PE标记的一抗，4℃孵育30min，流式细胞仪检测，对照管加无关一抗。以Cell Quese软件收集并分析数据，结果以平均荧光强度（MFI）表示。 　　1.2.2 半定量RTPCR HLAⅠ类重链、轻链的引物及扩增体系参见文献［4］，扩增抗原加工递呈分子的引物及扩增体系参见文献［5］。以βactin为内参照进行质控与标化，在PCR反应到达平台期前取扩增产物电泳检测。利用Gelpro32图像分析软件对凝胶进行密度梯度扫描，以βactin为内对照，对各条带进行比较分析。 　　1.2.3 Western blot 提取细胞总蛋白，以BCA法定量并调至相同浓度。等量蛋白经12%SDSPAGE电泳分离后，转移至PVDF膜，封闭后按顺序加入一抗和二抗，以化学发光法显影，X线曝光。 　　1.2.4 微卫星Marker选择与PCR扩增 基因组DNA常规酚氯仿抽提，5个微卫星序列位于6号染色体HLA基因区域，选自第13届国际组织相容性工作组大会“HLA和肿瘤”分组确立的一套微卫星标志，其引物设计及扩增条件参见文献［6］。 　　2 结果 　　2.1 胃癌细胞系表面HLAⅠ类分子表达情况通过流式细胞仪检测4株胃癌细胞表面的HLAⅠ类复合物的表达情况如图1所示，MGC803、BGC823 和SGC7901表达较高，其MFI分别为943.31、349.14和645.15。而MKN细胞HLAI类复合物表达明显减少，其MFI为90.80。 　　A. PE标记的无关一抗显示背景染色 B.胃癌细胞系表面HLAⅠ类复合物表达情况 　　图1 流式细胞仪检测胃癌细胞系中HLAⅠ类复合物的表达（略） 　　Fig 1 HLA classⅠcomplex expression on gastric cell lines. 　　A.Background staining using the isotype matched control anti