胶质细胞源性神经营养因子对局灶性脑缺血后海马齿状回脑电活动的影响_医学论文.docVIP

胶质细胞源性神经营养因子对局灶性脑缺血后海马齿状回脑电活动的影响_医学论文 胶质细胞源性神经营养因子对局灶性脑缺血后海马齿状回脑电活动的影响_医学论文 【摘要】 目的：观察胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对局灶性脑缺血大鼠在体海马齿状回脑电活动的影响。方法:制作右侧局灶性脑缺血模型，右侧脑室注射GDNF，通过神经电生理学方法，记录正常组、脑缺血模型组、生理盐水组和GDNF组大鼠局灶性脑缺血90 min后再灌注14 d海马齿状回的脑电活动，分析脑电频谱。结果:免疫组化检测显示，GDNF组各时间点BrdU阳性细胞较脑缺血模型组和生理盐水组增多。大鼠脑电图显示，GDNF组较脑缺血模型组和生理盐水组脑电活动恢复明显，组间比较有显著性差异（均0.05）。结论:GDNF可改善局灶性脑缺血后的脑损伤，促进激活内源性神经干细胞增殖、分化，改善脑缺血后的行为和脑功能。 【关键词】 局灶性脑缺血 海马齿状回 神经干细胞 胶质细胞源性神经营养因子 脑电活动 频谱分析 近年研究证实，脑缺血损伤能促使特定生发脑区的内源性神经干细胞（neural stem cells，NSCs）增殖、迁移，最终分化为终末神经细胞[1。但是，哺乳动物中枢神经系统损伤后,内源性修复能力不足，不能启动功能性轴突的再生，是脑损伤的替代治疗中亟待解决的问题。对脑缺血后脑内微环境的研究提示，神经营养因子不仅可促进神经系统发育，还对脑损伤的修复起重要作用。最近研究[3发现，胶质细胞源性神经营养因子（glial cell）能够促进多种神经元的存活和分化，但GDNF对脑缺血后内源性NSCs增殖分化的作用机制尚不明确。本课题组在对脑缺血后内源性NSCs再生的研究中证实，GDNF能促进海马齿状回颗粒层和颗粒下层NSCs的增殖、分化，并通过Y型电迷宫验证其对脑损伤后的学习与记忆能力的恢复有重要作用[5]。本研究采用神经电生理学的方法，记录脑缺血后GDNF对在体海马齿状回的脑电活动，并进行频谱分析，旨在进一步验证脑缺血后GDNF促进内源性NSCs增殖分化和对脑缺血的修复作用。 1材料和方法 1.1实验动物、主要试剂及检测仪器 选用成年雄性SD大鼠(由东南大学医学院实验动物中心提供)，4月龄，体质量340 400 ｇ。GDNF由晶美公司提供。江湾Ⅰ型C立体定向仪由中国上海第二军医大学提供，MD2000 Super Lab生物信息采集分析系统由南京医科大学生理学教研室提供。 1.2局灶性脑缺血模型制作及实验分组 参照Longa等[6]线栓法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。缺血90 min后，回抽尼龙线10 mm，完成再灌注后缝合伤口。观察模型大鼠清醒后的行为学改变，按Zea Longa五级评分标准评定动物的神经系统体征:0级,行为无明显变化；1级,左前肢屈曲，左后肢伸展；2级,有左侧追尾现象；3级,行走困难，摇摆不定；4级,无自发性活动，有意识障碍。本实验将1、2、3级大鼠确定为成功模型鼠。将模型鼠随机分为正常组、脑缺血模型组、生理盐水组和GDNF组，均于脑缺血再灌注第2、7、14天检测脑电活动，各时间点大鼠6只。 1.3 侧脑室注射GDNF 在造模前3 d，4%戊巴比妥钠腹腔麻醉下，将大鼠固定于脑立体定位仪上，参照Paxinos和Watson图谱第2版，取右侧脑室坐标为：以Bregma点为零点，AP=-3.8 mm，ML=-1.6 mm，DV=3.6 mm。颅骨钻孔置入金属双套管于右侧脑室，牙科水泥封闭骨孔和外套管。造模后即拔出内套管，GDNF组以1 μl·min-1、12 μl·（次·d）-1匀速注入0.1 mol·L-1 PBS和1 μg·ml-1 GDNF溶液，在检测脑电活动的各时间点前每天连续给药。注毕,将内套管插入外套管以封闭开口，按再灌注时间点连续注射至处死前1天。生理盐水组以同样方法等量注入生理盐水。 1.4 海马齿状回细胞增殖的检测[5] 各组大鼠在相应时间点处死前24 h后，腹腔注射BrdU(50 mg·kg-1),1次·h-1，共3次，末次注射12 h后处死。常规取材，选择海马齿状回部位，在恒冷式冰冻切片机上作连续冰冻冠状切片，片厚20 μm，每隔4张取1张贴片，进行免疫组化（SP法）检测。在加一抗前，切片作如下处理：50％甲酰胺/2×SSC、2 mol HCl、3%H2O2（37 ℃，15 min）、0.1%胰蛋白酶、正常羊血清封闭后，入小鼠抗大鼠BrdU抗体(1∶500，Sigma公司提供)4 ℃过夜,最后DAB显色。常规脱水、透明和封片，光镜下观察。任取一张切片用正常羊血清代替一抗进行阴性对照实验。 1.5 海马齿状回电极的埋植和脑电活动的记录及频 谱分析 各组大鼠在造模前3 d，右侧海马齿状回的定位坐标为：AP=-3.8 mm，ML=-