自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用_药学论文.docVIP

自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用_药学论文 自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用_药学论文 作者：杜标炎 张爱娟 谭宇蕙 易华 吴映雅 【摘要】 　　【目的】观察六味地黄丸含药血清协同HSV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用，探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性。【方法】构建HSV自杀基因治疗系统，确定丙氧鸟苷（GCV）工作浓度（39.2μmol/L）；选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清，并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响。设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组，以上3组均为无大鼠血清的对照组。空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中，所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度，每组设6个复孔。将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+ 和CBRH7919/tk-混合，使tk+ 细胞的比例分别占0%、5%、10%，按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板，用完全培养基培养细胞24h后，相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清，孵育12h，加入GCV，培养60h，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞存活率，用Q值（实测药效与理论药效的比值）分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性（0.85≤Q＜1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用）。【结果】空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性；血清浓度为体积分数5%和7.5%时，自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较，联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组，细胞存活率均有显著性差异（Ｐ＜０.０１）,而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性（Q＞1.15）。【结论】HSV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用。 【关键词】 肝肿瘤／中西医结合疗法 六味地黄丸／药理学 基因疗法 自杀基因 肿瘤细胞 培养 　　原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，传统的肿瘤治疗方法对原发性肝癌治疗效果欠佳。自杀基因治疗，可能在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发与转移，以及提高患者生活质量方面具有独特的优势，成为肝癌治疗活跃的研究领域［1-4］。单纯自杀基因治疗难以达到完全根治肿瘤的目的，需要通过各种方法进一步提高疗效。联合治疗是提高自杀基因治疗疗效的方法之一，目前国外的联合治疗方案主要包括联合免疫基因或联合放疗、化疗等［5］。但由于各种原因，上述联合治疗方案未能取得预期的理想效果。 　　临床与实验研究均已证明许多中药方药具有广泛的药理作用［6-8］，且具有多途径和多靶点的作用特点，将自杀基因疗法与中药方药联合应用，有可能通过自杀基因疗法的不同作用机制发挥更好的增效作用。六味地黄丸是滋阴补肾经典名方，前期研究工作表明六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗具有增效作用［9-10］。本研究拟通过体外实验作进一步地论证，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 主要试剂与仪器 　　RPMI为Gibco公司产品；新生牛血清为TBD公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）、丙氧鸟苷（GCV）、二甲基亚砜（DMSO）为美国Sigma公司产品；细胞培养瓶、培养板、冻存管、滤膜等均为美国Corning公司或丹麦NUNC公司产品；BNA型CO2培养箱（日本ESPEC）；超净工作台（苏州净化设备厂）；高速冷冻离心机（德国Sigma）；倒置显微镜（重庆COIC）；电子天平（日本岛津）；pH仪（意大利HANNA）；纯水器（韩国Human Corp）等。 　　1.2 细胞株 　　病毒包装细胞PT 67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSN质粒转染入PT 67细胞内构建了重组病毒包装细胞，记为 PT 67/tk［11］；大鼠肝癌CBRH7919细胞购于中山大学动物中心细胞库，前期已用PT67/tk的含病毒上清培养液感染大鼠肝癌CBRH7919细胞，筛选获得稳定整合和表达tk基因的重组大鼠肝癌CBRH7919/tk+细胞［12］。 　　1.3 实验动物 　　SD大鼠，体质量230～280g，雄性，健康，清洁级［动物合格证号SCXK（粤）2003～0001，粤监证字2006A014；环境合格证号NO 0010470］，由广州中医药大学实验动物中心提供。 　　1.4 GCV杀伤敏感性及GCV工作浓度的确定 　　大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk- 和CBRH7919/tk+ 在96孔细胞培养板中按每孔3×103个细胞、200μＬ总体积进行培养。在铺板24h 后加入GCV，设置终浓度分别为