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药用植物泰山四叶参DNA提取方法的研究_药学论文 药用植物泰山四叶参DNA提取方法的研究_药学论文 作者：史仁玖，王桂龙，宫元伟，郝岗平，王德才 【摘要】 　　目的探讨不同DNA 提取方法对泰山四叶参DNA 质量的影响。方法对提取的DNA 进行紫外光谱分析、总DNA 电泳及RAPD 分析。结果不同方法提取的DNA 质量及产率存在显著差异。结论结果表明改良CTAB 法和改良SDS 法较好。 【关键词】 泰山四叶参 基因组DNA DNA 提取方法 　　泰山四叶参Codonopsis lanceolata Benth.et Hook.，属桔梗科党参属，泰山四大名药之一，以根为药，具有补血通乳、养阴润肺、益胃生津之功效［1］。本研究旨在利用RAPD 分子标记技术构建不同产地四叶参DNA 指纹图谱，为四叶参真伪鉴定提供分子依据。高质量的基因组DNA 是获取可靠分子标记结果的前提。泰山四叶参多糖、蛋白含量高，不易去除，从而影响DNA 的纯度和浓度。本研究改进了传统的SDS法和CTAB法。采用改良方法所提取的DNA 可作为分子生物学研究的模板，这为RAPD 分子标记和后续的分子生物学研究奠定了重要基础。 　　1 器材 　　MyCycler梯度PCR 仪(Bio-rad 公司)，离心机(Sigma 3K30)，DNA 离心真空干燥器(Savan t)。 　　泰山四叶参叶片采自泰山药用植物园，贮存于-70 ℃冰箱备用。CTAB(上海生物工程技术有限公司) , SDS (上海生物工程技术有限公司)，PVP (上海生物工程技术有限公司)，β-mercap -toethanol (上海生物工程技术有限公司)，Taq 酶(Takara)，RAPD Primers(Opron 公司)。 　　2 方法与结果 　　2.1 DNA 提取方法及检测结果常规SDS 法：参照文献［2］操作;常规CTAB 法:参照文献［3］操作。 　　改良CTAB 法,参考文献［4］并改进：称取0.2 g 泰山四叶参叶片，液氮研磨成细粉状，加入600 μl核分离液［100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 50 mmol/L EDTA (pH 8.0), 700 mmol/L NaCl,2% PVP (W/ V) ,2％β-巯基乙醇(V/V)］，迅速研磨成匀浆状，转入1.5 ml 的离心管，4 ℃，5 000 r/min 离心10 min。弃上清，加入600 μl预热的CTAB 核裂解液［100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl,2%CTAB(W/V),2％PVP(W/V)］，65 ℃水浴保温60 min。冷却几分钟后加入600 μl氯仿/异戊醇（V/V为24:1），摇匀室温放置5 min，10 000 r/min 离心10 min，重复抽提1次。取上清，加入1/5体积的5 mol/L 的NaCl，加入2/3 体积的预冷异丙醇摇匀，室温放置15 min 后可见白色丝状DNA 沉淀析出。室温离心去上清后加入70% 的乙醇清洗2 次，真空干燥后加入200 μl TE 溶解沉淀，加入RNase A 至终浓度为10 μg/ml，37 ℃水浴保温30 min。加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10 000 r/min,室温离心10 min，取上清加入1/10 体积的3 mol/L NaAc（pH 5.2）,混匀后再加入2 倍体积的无水乙醇，-20 ℃ 放置30 min。离心，弃上清，70%的乙醇清洗2次，室温风干后溶于50 μl的TE 中，-20 ℃ 贮存备用。 　　改良SDS 法，参考文献［5］并改进：称取0.2 g四叶参幼叶于预冷研钵中，液氮研磨成细粉状后立即加入600 μl核分离液，迅速研磨成匀浆状，小心转入1.5 ml的离心管。4 ℃，5 000 r/min离心10 min;弃上清，加入600 μl预热的SDS 核裂解液，同时洗净管盖及管壁上残留的植物组织，用灭菌牙签轻轻混匀，65 ℃水浴保温60 min，期间不时轻轻摇动离心管几次;冷却几分钟后加入600μl氯仿/异戊醇（V/V为24:1）摇匀室温放置5 min,10 000 r/min,离心10 min。转移上清，重复抽提1次；取上清，加入1/5 体积的5 mol/L 的NaCl，混匀,加入2/3 体积的预冷异丙醇摇匀。4 ℃放置30 min，此时可见白色絮状DNA 沉淀析出于离心管液相中上部，而细胞碎片及其它杂质沉淀于离心管底部；用灭菌牙签将DNA 沉淀挑出，用70% 的乙醇漂洗2次，真空干燥后加入200 μl TE溶解沉淀，加入RNase A 至终浓度为10 μg/ml，37 ℃水浴保温30 min；加入等体积