医学检验中的光谱分析技术.pdfVIP

第三篇　临床生物化学检验 第二十四章　光谱分析技术 光谱分析指利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定 量的分析方法。它具有灵敏、快速、简便等特点，是生物化学分析中最常用的分析技 术。 光谱分析技术可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱三大类。基于发射光谱分析的 方法有火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法；基于吸收光谱分析的方法有紫外、 可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法；基于散射光谱分析的方法有比 浊法等。 第一节　分光光度技术的基本原理 分光光度技术是利用物质对光的吸收作用对物质进行定性或定量分析的技术。分光 光度法是光谱分析技术中最常用的一种，应用最多的是紫外－可见光分光光度法。 一、吸光度与透光度 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸 收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I，透射光强度为I，I和I之比称为透 0 0 光度 t（ransmittance，T），即 T＝I／I 0 T×100为T％，称为百分透光度。 透光度的负对数称为吸光度 a（bsorbance，A），即 A＝－lgT＝－lgI／I＝lgI／I 0 0 二、Lambert－Beer定律 Lambert－Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定 律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为： A＝KLC 式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶 液浓度。 Lambert－Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。 根据Lambert－Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol／L时，吸光系数K称 ·455 · 第三篇　临床生物化学检验 为摩尔吸光系数 （ε）。ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol／L时在特定波 长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。在固定条件 （入射光波长、温度等）下，特 定物质的ε不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。通过对已知浓度的溶液测定 其吸光度，可求得某物质的ε。 三、偏离Lambert－Beer定律的因素 按Lambert－Beer定律，某一种物质在相同条件下，其浓度和吸光度成正比，应用 Lambert－Beer定律产生误差主要来源于光学和化学两方面的因素。 1．光学因素 Lambert－Beer定律要求入射光是单色光，在目前的分光条件下，所分出的单色光并 不是严格的单色光，而是包括一定波长范围宽度的谱带，其它波长的杂色光是引起误差 的主要原因。入射光的谱带越宽，其误差越大。 2．化学因素 浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡，使被测物质的浓度因离解、缔合 和形成新的化合物而发生变化，从而使吸光度和浓度不成线性关系。 第二节　分光光度计的基本结构 分光光度计的类型很多，最常用的是可见分光光度计和紫外－可见光分光光度计。 各种类型的分光光度计的结构和原理基本相同，一般包括光源、单色器、比色杯、检测 器和显示器五大部分。 一、光源 光源指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域 内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应 随波长有明显的变化。实际上许多光源的强度都随波长变化而变化。为了解决这一问 题，在分光光度计内装有光强度补偿装置，使不同波长下的光强度达到一致。 可见光分光光度计常用光源是钨灯，能发射出350nm～2500nm波长范围的连续光 谱，适用范围是36