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第三节 互补测验 一、互补测验原理和方法 1、互补测验的原理 互补测验是确定突变的功能关系的一种常用方法。用不同的rⅡ突变型成对组合同时去感染大肠杆菌K(λ)菌株。如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体(也有少量重组型的噬菌体)，那么就必然是一个突变型补偿了另一个突变型所不具有的功能，这两个突变型就称为彼此互补(complementation)。如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤(图4-4)。 2、互补测验的方法 斑点测试法（spot test）：用一种rⅡ突变型以0.1的感染比（噬菌体1／细菌10）去感染大肠杆菌K（λ）菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在营养平板上，琼脂凝固后，在平板上所划出的一定位置上再加一滴含有另一种rⅡ突变型的培养基，在这一滴培养基的范围内，一些细菌就会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌斑，就证明这两种突变型互补，相反就不能互补。在一个培养皿平板上可做6～8个斑点试验。 互补测验的结果发现，除了一些缺失突变型外，rⅡ突变型可分rⅡA和rⅡB两个互补群。所有rⅡA突变型的突变位点都在rⅡ区的一头，是一个独立的功能单位；所有rⅡB突变型的突变位点都在rⅡ区的另一头，也是一个独立的功能单位。凡是属于rⅡA的突变之间不能互补，同理属于rⅡB的突变之间也不能互补，只rⅡA的突变和rⅡB的突变之间可以互补，即双重感染大肠杆菌K（λ）菌株后可产生子代。说明rⅡA和rⅡB是两个独立的功能单位，分别具有不同的功能，但它们的功能又是互补的，要在大肠杆菌K（λ）菌株中增殖，这两种功能缺一不可。由此可见，rⅡ是由于这两种遗传功能丧失而形成的。 二、顺反子 1、基本概念 反式排列：用于互补测验中所用的两个突变型，如果分别位于两条染色体上，这种组合方式称为反式排列， 顺式排列：如果两个突变同时位于一条染色体上，则称为顺式排列。 顺反子：将不同突变之间没有互补的功能区称为顺反子，顺反子就是一个功能水平上的基因。 2、互补测验的遗传学分析 在互补测验中，两个隐性突变如表现出互补效应，则证明这两个突变型分别属于不同基因；如不能表现出互补，则证明这两个突变型是在同一基因内。顺式排列只是作为对照，因为在顺式排列中，不论是两个基因的突变，还是同一个基因内两个位点的突变，在互补测验中均表现出互补效应（图4-5）。这也就是说，对于不同基因间的突变型在互补测验中，不论是顺式还是反式排列均表现出互补效应；但如果是属于同一基因的不同位点的突变，则顺式构型表现互补，反式构型则不能互补。 三、基因内互补 在互补测验中已知，一般情况下同一顺反子内两个突变是不能互补的，但是也有一些例外，这种例外发生于同一基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同位点上发生变异的多肽链，而后将这两条多肽构成双重杂合子，这两者配合起来，有可能表现出程度不同的恢复酶活性部位，这种现象称为基因内互补（intragenic complementation）。这可能是由于有些突变所影响的多肽区域是作为亚基而相互起作用的，而有些突变所影响的多肽区域是作为活性表达所必须的，但不参与亚基的相互作用（图4-6）。 虽然基因内互补对互补测验存在一定的干扰，但通过进一步研究发现，基因内的互补作用与基因间的互补作用是可以区分开的：①任何两个不同基因突变总是互补的，即基因间互补是普遍存在的，而同一基因内不同位点突变绝大多数是不能互补的，只有少数例外；②基因内两个突变能互补的也只能是点突变，无缺失，这种突变一定是错义突变，决不是无义突变或移码突变；③基因内互补作用的酶活性往往明显低于正常水平，最多只有野生型酶活性的25％，同时所形成的蛋白质也常有某种异常，例如温度的稳定性或pH依赖性等。