滚环扩增法检测副溶血性弧菌.pdfVIP

201l食品安全技术与标准国际研讨会暨AOAC中国区会议论文集 滚环扩增法检测副溶血性弧菌 张健¨姜英辉2管斌1雷质文2房保海2 1(中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266000) 2(山东出入境检验检疫局，青岛266000) 摘要：为建立快速准确的副溶血性弧菌的检测体系。本文根据滚环扩增方法的原理设计引物、锁式探针以及反应 体系。试验证明rRCA检测体系具有很好的特异性、灵敏度和稳定性，适用于副溶血性弧菌的检测和鉴定。 关键词：滚环扩增副溶血性弧菌锁式探针 1 引言 副溶血性弧菌是海产品中常见的食源性致病菌，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要 症状。传统的副溶血性弧菌的检测方法大概分为前增菌，二次增菌，分离纯化，四项初筛生化试验，八项生 化确认试验Il】。由第一步到最终确定结果做快也要5天时间，费时费力难以满足微生物检测机构对副溶血弧 菌检测上作的需要，确实的需要更快更准的方法来替代传统检测方法。 滚环核酸恒温扩增技术(Rolling 该技术模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条与靶序 列瓦补的引物引发沿环形DNA模板的链置换扩增，实现环状DNA模板的体外恒温线性扩增【2，3J。在此基础 上增加一条与DNA模板序列一致的引物，RCA则可以实现模板的指数扩增。如果把技术稍加改进，也可以 实现对线性靶序列的检测。在反应体系星加入锁式探针，锁式探针在连接酶作用下以线性靶序列为模板连接 双链。该技术具有灵敏、特异、恒温扩增等的特点，已被用于全基因组测序、细胞原位检测、芯片技术、免 疫组化、单核苷酸多态性(SNP)检测等方面。 2材料与方法 2．1实验菌株 保藏管理中心(CMCC)，分离菌株源自本实验室分离鉴定所得。 201l食品安全技术与标准国际研讨会暨AOAC中国区会议论文集 2．2试剂 DNA DNA DNA Taq ligase(Biolabs)、Bstpolymerase(Biolabs)、Taq l(Bi01abs)、100DNAladder(天根)。 bp )。 2．3锁式探针及其扩增引物的设计 Premier 6．0及Primer5设计锁式探针【41。所有寡核苷酸引物和探针 依据锁式探针的设计原则并采用Oligo 均由上海有限公司合成。探针与引物序列如下： PV二PLP： · AACAAGCGAATTGGAGTGTrGGGCTrCCCA TGCCATTCATCCGCTrATl’ATCACCCGTAGGTGGCACATGC PV-F-CATGTGCCACCTACGGGTGA PVoR：ACAAGCGA芦胛GGAGTGTrG 2．4实验步骤 2．4．1核酸的提取 BacteriaDNA Kit)，根据试 取实验菌株的细菌培养液lmL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp 剂盒说明书提取细菌DNA，保存于一20℃备用。所制备的模板，用于特异性和灵敏度等试验。 2．4．2锁式探针的连接【63,8l DNA连接酶缓冲液l 锁式探针的环化连接反应在10J-tl体系中完成：10XTaq pl，200pmol·L．1线性锁式探 DNA连接酶0．1 4min； 针0．2p