第24章病毒感染的检查方法与防治原则.docVIP

第24章 病毒感染的检查方法与防治原则病毒感染的检查方法 通过病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。临床医师根据流行病学资料疾病的症状与体征综合判断可能为何种病毒感染，留取适宜的标本送检。 一、标本的采集与送检 （一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本采集原则 1标本采集时间 在发病初期（急性期）采集标本，较易检出病毒，随着标本采集日期的推后，病毒分离的阳性率随之降低。例如麻疹病毒分离标本必须在出疹前三天出疹后五天内采集；而脊髓灰质炎病毒分离标本尽量在发病后14天内采集。 2标本类型 最好在感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液、咽拭子、鼻拭子等；肠道感染采集粪便标本；脑内感染采取脑脊液；皮肤感染采取病灶组织，如疱疹液体；有病毒血症时采取血液；对某些病毒尿液标本的分离率也比较高。 3标本运输 病毒是细胞内寄生物，脱离活体后在室温下很易丧失感染能力。标本采集后，应放入装有冰冷藏包内尽快运送到实验室，标本在处理、接种前切忌反复冻融，病变组织则应保存于50%的甘油缓冲盐水中。 4标本的处理储存收到标本后，应尽快处理并保存标本，处理前，含有有包膜的病毒的临床标本中可加入高浓度的青霉素、链霉素、等；对无包膜的病毒的临床标本，可在标本内加入一定量的氯仿。标本中加入抗生素或氯仿的目的是杀灭标本中可能存在的细菌、支原体、真菌等病原体。处理后的标本要加入一定量的标本保存液（例如，含2%胎牛血清的MEM、DMEM、PBS等），尽量及时接种，如不能当时接种，标本应保存与-70℃低温冰柜或液氮中。 （二）供血清学检测的标本采集原则 检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期双份血清，第一份尽可能在发病后立即采取，第二份在发病后1个月时采集。血清标本应在-20℃保存，试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及补体。无菌性脑炎患者也可取脑脊液检测特异性lgM。 二、病毒分离 （一）细胞培养(cell culture) 接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达23个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是黄金标准，即其准确性高而无误。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的几率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。 3种基本类型。 （1） 原代细胞培养(rimary cell culture) ：用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育12天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 （2）二倍体细胞培养(iploid cell cultune)：原代细胞只能传23代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃）内，为种子，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。 （3）传代细胞培养 (ontinous cell culture) ：由癌细胞或二倍体细胞突变而来，染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。HeLa（）KB（）HEp-2（）Vero（）。-70℃～-196℃）且对某些病毒易感，因此，在诊断、科研等非疫苗生产的项目中常被采用。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用 （4）淋巴细胞培养（ymphocyte culture）正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在加入T细胞生长因子（IL-2）后可在体外培养，为研究人类逆转录病毒（HIV、HTLV）提供了条件，HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。 2．细胞培养中病毒的鉴定。 （1）病毒在细胞内增殖的指征1）细胞致病作用(ytopathogenic effect, CPE)：病