共附生微生物抗肿瘤活性菌的筛选、鉴定及活性产物的研究.pdfVIP

共附生微生物抗肿瘤活性茵的筛选、鉴定及活性产物的研究 摘要 癌症是当今危害人类健康的主要疾病之一，严重威胁着人类的生命。目前医学临床上 常用的大多数药物只能使病情缓解，无法达到完全治愈的目的，所以抗肿瘤新药的开发一 直是药物研究领域的主要方面。微生物在自然界物质循环过程中维持着生物圈的动态平 衡，很多微生物和动植物保持着共生或附生的关系。动植物体内的共附生微生物因其所处 宿主环境的不同而显示出较为独特的代谢途径与生理活性。共附生微生物被认为是天然活 性产物的重要来源。 本实验以人宫颈癌HeLa细胞为筛选模型对分离自海绵和植物组织的一些共附生微生 物进行抗肿瘤活性菌株的筛选。分别采用了MTT法、SRB法、染料排斥法这三种细胞毒 筛选方法对252株微生物菌株的发酵提取物进行了抗肿瘤活性的筛选，比较了三种方法的 筛选结果，选取了7株具有良好抗肿瘤活性的菌株。重点对一株植物内生真菌YX．5进行 了鉴定、发酵条件优化、活性产物稳定性的研究，还通过硅胶柱层析，反相柱层析等分离 方法对其活性产物进行了分离，通过GC．MS、NMR等手段对主要的活性成分进行了鉴定。 通过本论文的研究为环境微生物资源以及抗肿瘤活性物质的开发提供了一定的实践基础。 论文主要研究结果如下： 本一致，具有较好的相关性。经复筛后确定有6株细菌和1株真菌具有良好且稳定的抗肿 瘤活性，其提取物在100 YX．5对HeLa细胞的IC50达到了5．33肛g／mL。 (2)经场发射扫描电镜观察、菌落形态观察以及ITSrDNA序列分析，初步鉴定真菌 oryzae)。 YX-5为米曲霉(Aspergillus (3)通过控制发酵培养基、pH、发酵温度、发酵时间以及摇床转速等条件，以菌体 干重，代谢物产量以及抗肿瘤活性为指标，确定YX．5的最佳发酵条件为GPY培养基发酵， 发酵温度25。C、发酵时间7 r／min。 d、适宜pH为7．0、摇床转速110 (4)以高温、pH、紫外线和蛋白酶处理下代谢产物的抗肿瘤细胞活性为指标，对YX-5 活性产物的稳定性进行了研究。结果显示，菌株YX．5的代谢产物对紫外线和蛋白酶处理 有较高的抗性，在超过100℃或在碱性环境中稳定性有较大幅度的下降，不过仍然具有一 定的抗肿瘤活性，总体来讲YX．5的活性物质稳定性较高。 (5)YX-5经规模化发酵(25L)、发酵液乙酸乙酯萃取后，得到粗提物5．15 g，将粗 提物按极性高低初步分为三部分：正己烷相、二氯甲烷相和65％甲醇水相，经SRB法测定， 活性组分主要集中在二氯甲烷相。采用薄层层析法选择分离YX-5活性产物的溶剂体系和 溶剂比例，结果表明，二氯甲烷和甲醇体系适用于YX．5活性产物的分离。在初次的硅胶 层析柱时，以甲醇含量分别为2％、10％、20％、100％的氯仿．甲醇洗脱体系进行梯度洗脱， 结果显示活性组分主要集中在10％甲醇洗脱段。经两次ODS反相柱层析后对柱分离产物 及混合氢谱核磁共振大致确定主要的活性物质为一些曲霉酸和环二肽类物质。 关键词：共附生微生物；抗肿瘤活性；筛选鉴定；发酵条件；活性物质 JlIHMIIIMIIIHJ andIdentifica锄。fthe Scree血g MicrobialIsolatesandActive Symbiotic Compounds Thereof ABSTRACT Cancerisoneofthemost diseasesintheworld current life-threatening now,and usedin cancercan relie