人胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)在母鸡输卵管中表达及其相关研究.docVIP

人胎盘碱性磷酸酯酶（PLAP）在母鸡输卵管中表达及其相关研究 【摘要】：随着基因转移技术的不断发展和完善，利用转基因动物来生产基因药物是一项可以获得巨额经济利润的新型产业。目前采用生物工程方法生产的大多数药用蛋白为糖蛋白，其中寡糖链对糖蛋白生物学功能的体现非常重要。在常用的几种表达系统中，大肠杆菌表达系统因缺少蛋白质糖基化修饰所需的糖基转移酶，故不能对所表达的糖蛋白进行糖基化修饰；酵母和昆虫表达系统虽可以对其所表达的蛋白质进行糖基化修饰，但与哺乳动物细胞的修饰方式差异很大。哺乳动物的研究中，有许多蛋白是在转基因鼠、兔、猪、绵羊、山羊和奶牛等的乳腺细胞中表达的，而哺乳动物乳腺反应器也存在如下不足或缺陷：世代间隔时间长，乳汁中的生化成分复杂，以及重组蛋白纯化的难度大等。为此科学家试图建立另外一种新的生物反应器——鸡蛋生物反应器。与其它反应器相比，该反应器有蛋白产量高、易纯化和生产周期短等优点。人胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)是一种糖蛋白，该基因具有表达后容易检测、灵敏度高等优点，而在医学临床检测中被广泛使用，为此本课题将其选为报告基因。本实验同时选用具有雌激素受体的人乳腺癌MCF-7细胞和ZR-75-30细胞、不具有雌激素受体的大肠癌细胞和原代培养的鸡胚细胞，来研究鸡细胞的糖基化和卵清蛋白基因启动子的雌激素依赖性表达调节，通过母鸡输卵管组织特异性表达体系的建立，实现PLAP在母鸡输卵管中的表达。1人胎盘碱性磷酸酯酶(plap)基因的获得采用SOEPCR方法从pSEAP2-control质粒扩增plap基因，引物5′端设有一个BamHI酶切位点，3′端引物上设有一个XhoI位点。同时，因plap基因内部有一个BamHI限制性酶切位点，因此需要再设计一对引物，在不改变氨基酸序列的条件下，使基因内部的BamHI酶切位点突变，即扩增plap基因需要分两步完成，第一步从pSEAP2-control质粒扩增获得plap基因的两个片段，第二步通过PCR方法将两个片段连接起来，获得全长plap基因。2plap基因克隆及在大肠杆菌中融合表达将所获全长plap基因克隆到pSK载体上，构建pSK-plap质粒，并进行测序，再从pSK-plap质粒上切下测序正确的目的片段，克隆到大肠杆菌融合表达载体pET-32a上，经PCR扩增和限制性内切酶酶切鉴定后，鉴定正确的克隆转化到大肠杆菌菌株中表达，采用10％不连续SDS蛋白电泳检测目的蛋白表达情况。用华东师范大学博士学位论文大肠杆菌中融合表达的PLAP制备小鼠多克隆抗体，并通过Westemblotting杂交检测自制的小鼠多克隆抗体。3构建含plar基因的鸡输卵管组织特异性表达载体pAB一519一SV40的基本组成元件如下:l)调控输卵管特异性表达的启动子为ovalbumln基因的启动子，长度为1.45kb;2)ovalbulnin基因的第一个内含子，用来提高目的蛋白的表达量，长度为1.55kb;3)sV40的largeT抗原的转录终止子，长度458bp，含polyA添加信号;4)MAR(Matrixattaehmentregion)元件和ARs(autonomouslyreplieatingse明enees)元件，均以pCR手段从鸡、鼠的总DNA得到，长度为300一soobP;将在大肠杆菌中表达目的蛋白的plar基因片段，克隆到鸡输卵管组织特异性表达载体印AB一519一SV40)上。4转基因鸡生产1)pAB一519一lar一SV40质粒的大量制备。将大量抽取的质粒pAB一519一laP一Sv40用限制性内切酶KPnl酶切，使其线性化，纯化质粒后，分光光度计测定质粒的浓度。2)制备脂质体并包埋表达载体DNA，脂质体的大小通过控制组份比例调制在小200nm左右。每毫升脂质体包埋100ug纯化后的I)NA。3)采集新鲜精液，用37预温的冷ebs溶液洗精液，离心后收集精子并用K淦ebs液悬浮，加入包埋有线性化输卵管组织特异表达质粒DNA的脂质体，混匀后37保温20分钟，立即进行人工授精。4)人工授精3天后收集鸡蛋，37孵化21天得第一代转基因鸡。采用穿翅号、断趾、剪鸡冠进行标记，然后进行常规的饲养和管理。5转基因母鸡的检测抽提鸡冠基因组DNA，按plaP基因序列设计并合成引物，以pAB一519一laP一SV40质粒模板为阳性对照，阴性对照采用不加任何模板、非转基因鸡基因组DNA及含有等摩尔浓度pAB一519一zop一SV40质粒的非转基因鸡总DNA为模板，对“转基因”第一代鸡基因组DNA中川aP基因进行PCR检测，检测片段长度为57obP。共孵化获得两组转基因鸡，第一组有95羽母鸡，第二批有128羽母鸡。经PCR方法检测，第一组转基因阳性率为75%，第二组阳性率为81%。PCR阳性转基因鸡每个细胞中转基因质粒的拷贝数