对氨基脲敏感的胺氧化酶生物功能化色谱的方法学研究.pdfVIP

第36卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第10期 Chinese of 1349—1353 2008年10月 Journal AnalyticalChemistry 对氨基脲敏感的胺氧化酶生物功能化色谱的方法学研究 厉红 屈锋徐建栋 邓玉林+ (北京理工大学生命科学与技术学院。北京100081) 摘要采用毛细管电泳法建立了对氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)生物功能化色谱模型。将SSAO酶固载 到一种仿细胞膜的载体——脂质体上，pH值对固定化酶稳定性影响的实验表明，pH5．0是理想的固载条件； mmol SSAO酶活性检测表明游离态和同定态的酶活性分别为0．0404和0．0347g。min～。将有活性的固定 化SSAO酶作为假固定相添加到磷酸盐缓冲液中(10 5)。随着固定化酶的浓度从0．004 mmol／L，pH g／L上 升到0．856 g／L，其特异性底物苯甲胺的有效淌度从4．06×10。4cm2／(V·s)下降到0．81×10‘4cm2／(V·s)。 据此，建立的生物功能化色谱模型为研究生物分子间的特异性作用提供了新的技术方法。 关键词生物功能化色谱，毛细管电泳，胺氨化酶，脂质体，苯甲胺 1 引 言 生物体内大多数生物过程都在某种意义上与色谱的作用机理类似，因为在这些过程中，物质的行为 都是由诸如色散力、静电力和氢键力等分子间作用力决定的。色谱已经是相对比较成熟的分析技术，但 是目前的大多数色谱分析仍局限于分离和定量分析。如果利用色谱来模拟生物过程，即赋予固定相具 有某种生物功能，利用色谱来模拟生物体内环境，必将赋予传统的色谱技术以新的生命力。 本研究提出了生物功能化色谱的概念，即通过模拟生物过程，在色谱模式下实现测定生物功能的目 的【lJ。选择的载体是脂质体，它是由磷脂双分子层构成的、类似于细胞膜的囊泡状结构；再将固载有固 定化酶的脂质体作为假固定相，添加到电泳缓冲液中，通过其底物有效淌度的变化，来验证酶对底物的 特异性亲和作用。 将脂质体一蛋白质复合物作为固定相应用于毛细管电泳的研究为数不多，主要用于分离化合物。 Bo等¨’到将溶菌酶和抗生物素蛋白键合到磷脂涂渍的熔融硅胶毛细管柱内，并将此复合物作为固定相 用于手性分离。 以上研究并没有注重蛋白质的活性，但在本研究中，选择组织固定型对氨基脲敏感的胺氧化酶 amine (semicarbazide．sensitive 用。SSAO酶广泛分布在不同的器官和组织中M。J，包括肺脏、肾脏、脂肪组织、软骨组织及血管平滑肌 等。由于它是一大类酶系，因此没有专一性底物。很多胺类物质，包括甲胺、苯甲胺、犬脲胺、精胺、5一羟 基色胺等都是它的底物，其中SSAO酶对苯甲胺的亲和度最大J。因此，苯甲胺常在研究中被用做底 物【9J。此外，SSAO酶的生理活性非常复杂，关于其生理作用也有多种假说¨¨121。研究认为，其活性影 响到一系列和酶活有关的多种代谢途径，在这些代谢途径中会产生甲醛、过氧化氢等具有很大细胞毒性 的物质，从而引起代谢紊乱、蛋白沉淀、糖尿病并发症等。本实验以毛细管电泳法测定SSAO酶的底物 苯甲胺的有效淌度，来表征生物分子之间的特异性作用。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 R-201型旋转蒸发仪(上海申顺生物科 Trisepn‘-2100加压毛细管电色谱(上海通微公司)；SENCO 2008-01-25收稿；2008-04．14接受 本文系国家自然科学基金(No资助项目 ·E—mail：deng@bit．edu．cn 万方