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疟原虫镜检技术 2014.6 疟疾简介 疟疾是由疟原虫寄生于人体引起的一种具有传染性的寄生虫疾病,即疟原虫是疟疾的病原体。疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门孢子纲真球虫目疟原虫科疟原虫属。 寄生人体的四种疟原虫 寄生人体疟原虫有4种 间日疟原虫 [Plasmodium vivax，P.v] 三日疟原虫[P．Malariae,P.m] 恶性疟原虫 [P．Falciparum,P.f] 卵形疟原虫[P．Ovale,P.o] 疟疾实验室诊断 目前用于疟疾诊断的实验室检测包括病原学检查、免疫学检测和分子生物学检测三类。 检出疟疾的病原体—疟原虫，是明确诊断疟疾的最直接证据。厚、薄血膜镜检疟原虫由于具有操作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等优点，广泛用于疟疾的病原学诊断已愈近一个世纪。时止今日，由于技术的、经济的等原因，镜检疟原虫仍是我国疟疾病例确诊的金标，被确认为诊断疟疾国家标准方法（WS 259-2006）。 血膜的制作（取血时间） 取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普 查时可不考虑取血时机。 在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；36~48小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。 血膜的制作（取血操作） 取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针采血，一人一针，避免血传疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向挤压出血。 取血部位 血膜的制作（取血量及涂片法） 薄血膜 取洁净的载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1~2微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5厘米长）。制成的血膜要求血细胞分布均匀，无裂缝，整个血膜成舌形。 正确的推片姿势 涂制厚、薄血膜的位置 标准的疟疾厚、薄血膜片位置 制作血膜的注意事项 1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。 制作血膜的注意事项 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。 制作血膜的注意事项 3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。 血片的染色 染色液的制备 目前常用的血膜染剂有吉氏和瑞氏两种。 吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。 瑞氏染色法因操作简便，常用于个别血片的染色。 血片的染色 血片的染色 2. 瑞氏染液的配制 瑞氏染剂粉1g， 甘油15ml， 甲醇500ml。 将瑞氏染剂粉1g置于研钵内，加入15ml甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。 此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液效果稳定，又不能大量血片染色，可用于门诊应急血片用。 吉氏染液的染色方法  血膜的固定和溶血 血膜在固定和溶血前必须充分自然晾干。先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。在固定薄血膜后用蒸馏水