重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染_医学论文.docVIP

重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染_医学论文 重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染_医学论文 作者：任书荣 高美华 王秋波 王静　　［摘要］目的 获取人突变CD59基因（HM3）并构建HM3真核表达体系，转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），以获得稳定转染的细胞克隆。方法 应用重组PCR定点诱变技术获得突变的CD59 DNA，进一步构建重组质粒 pALTER-HM3 与pcDNA3共转染CHO细胞，转染细胞按一定比例稀释后加入G418压力筛选稳定转染细胞克隆，传代扩增培养并及时冻存备用。结果 酶切及序列测定均证实成功构建了突变的pALTER-HM3重组质粒转染细胞培养约2周后套取出G418抗性细胞克隆，获得生长较好的细胞。结论 重组PCR定点诱变技术成功获得突变DNA，合适的细胞稀释有利于转染细胞克隆的筛选纯化。 　　［关键词］ CD59质粒转染聚合酶链反应 　　［ABSTRACT］ObjectiveTo construct a human mutant CD59 （HM3） eukaryotic expression system and transfect it into CHO so as to get a stable-transfection cell clone. MethodsHM3 DNA was performed by recombinant PCR using human CD59 cDNA template and designed mutagenic primers. HM3 DNA was inserted into the mammalian expression vector pALTER and transfected into CHO together with the selection marker pcDNA3， which conferred resistance to G418. The mutant clones were propagated in great amounts for further research. ResultsRecombinant plasmids of pALTER- HM3 were successfully construc-ted according to analysis of sequence and enzyme digestion. The mutant gene was about 500 bp. Stable transfectants were selected by the addition of G418. ConclusionHM3 DNA is successfully constructed. Appropriate cell dilution is useful to get purified transfected cell clones. 　　［KEY WORDS］CD59 plasmids transfection polymerase chain reaction 　　白细胞分化抗原59（CD59）为1988年由SUG-ITA等人发现的一种对补体膜攻击复合物（MAC）发挥抑制作用的因子，命名为攻膜复合物抑制因子（MACIF）［1］。1989年2月，在维也纳召开的第四届国际人类白细胞分化抗原会议上，正式被命名为CD59。CD59广泛分布于各种组织细胞表面，相对分子质量约18 000～20 000。CD59既可结合C8，也可与C9结合，阻止MAC的形成及后续C9分子结合到MAC上，保护自身正常细胞免受补体损伤，起同源限制作用［2］。其异常和缺损是导致夜间阵发性血红蛋白尿的直接原因［3］。文献报道，人类糖尿病血管增殖并发症的发生与补体调节蛋白CD59糖基化后失活有关［4］。本课题即根据有关研究构建CD59突变基因，通过转基因技术获得CD59糖基化 位点38位赖氨酸至44位组氨酸（K41～H44）改变的突变CD59分子。旨在进一步研究突变CD59的活性，从分子水平证实CD59基因突变与糖尿病血管硬化症的相关性，从另一角度研究糖尿病血管增殖症的发病机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1质粒、菌株与细胞株 真核表达载体pAL-TER-MAX（以下简称pALTER）购自Promega公司共转染质粒pcDNA3购自Invitrogen公司含正常人CD59 cDNA-pALTER重组质粒由哈佛大学医学院提供大肠杆菌DH5α由本室保存CHO细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。 　　1.1.2主要试剂 限制性内切酶EcoR Ⅰ购自TakaRa公司RPMI-1640、F12培养基购自Hy-cl