高效液相色谱法 （HPLC）.pptVIP

8、薄层层析色谱 是色谱法的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱，它集柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于少量样品(几微克，甚至0.01微克)的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此又可用来精制样品。此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板(如玻璃板、塑料片、金属板等)上，形成薄层(常用厚度为0.25毫米左右)后，在此薄层上进行层析分离的方法。 此法在杂环类药物的鉴别实验中有广泛应用。 流动相选择该注意的几点问题 1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微量杂质长期积聚而损坏色谱柱； 2、避免流动相与固定相发生相互作用而使柱效下降或损坏柱子； 3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积； 4、流动相同时还应满足检测器的需求。 液相色谱分离类型参考表 样品 相对分子量 2000 排阻色谱 溶于水 水为流动相 不溶于水 非水流动相 具 有 亲和性 亲和色谱 小结：分离类型选择 相对分子量 2000 不溶于水 同系物 分配色谱 异构体 吸附色谱 溶于水 不离解 反相液液色谱 可离解 阴离子交换色谱 阳离子交换色谱 离子对色谱 离子色谱 高效液相色谱法 （HPLC） 色谱法定义 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。 目 录 一、液相色谱分析法的发展 二、液相色谱分析法的特点 三、液相色谱仪 四、液相色谱分析法的原理 五、高效液相色谱法的主要类型及原理 六、高效液相色谱分析法的应用 七、分离数据的处理方法 八、参考文献 一、液相色谱分析法的发展 20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 　　 随着色谱理论的发展、高效细微固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。 类比 液柱色谱法和跑道赛跑 二、液相色谱分析法的特点 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。 兼具分离和分析功能，可以在线检测。 高效液相色谱法的突出特点： 1）高压（150－350*105Pa） 2）高速 3）高效 4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光 10-11g ） 三、液相色谱仪（1） 三、液相色谱仪（2） 四、液相色谱分析法的原理 （一）高效液相色谱分析的流程 　　 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。 2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。 3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度， 　　而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 四、液相色谱分析法的原理 （二）高效液相色谱的分离过程 　　 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 　　 流动相 固定相 64 0 0 0 0 0 3 1 18 6 27 9 流动相 固定相 分配系数：物质在两相溶剂中分配平衡时的比例 分配系数：1 分配系数：3 32 32 32 16 16 16 16 16 16 8 8 8 8 操作过程图示 四、液相色谱分析法的原理 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。 所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合