TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪ADD1+mRNA方法的建立与应用.pdfVIP

．364· 第四部分 猪遗传育种 DDlm 猪A RNA方法的建立与应用 崔景香，胡艳霞，杨伦，陈其美，杜金芳，陈伟，石元，祝洪磊，曾勇床‘ (山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018) 引育 近年来，随着人们生活水平的提高，猪肉的肉质问题得到了消费者和生产者重视，遗传基础是改善肉品质的关 anddifferentiation determination factor-1，ADI)I)在脂肪细胞分化中起 键。猪脂肪细胞定向和分化因子l(Adipocyte 着重要作用，准确度量脂肪组织中A肋，mRNA的表达量成为许多学者所关注的重点之一，因而建立有效的A肋J mRNA定量方法也是非常必要的。本研究旨在通过’r-A克隆法克隆猪ADDIcDNA，做为ADDImRNA实时荧光定 量检测质粒标准品，从而建立一种准确、简便的检测方法。为探讨脂肪细胞分化机理，以及其如何调控肉质性状提 供依据。 材料与方法 实验动物为去势的莱芜猪，在标准饲养管理条件下饲喂至114kg左右时屠宰，宰后立即取背最长肌和背膘样 品，分别用于肌内脂肪(Intramuscular cDNA，经EcoRI、 Vector，构建重组质粒后，通过T-A克隆法克隆猪A加J 扩增，产物回收纯化后连接到pMDl8-T HindlIl双酶切鉴定，测序验证ADDI和GAPDH重组质粒的正确性，制作标准品。 结果 本研究成功地建立了猪ADDI和GAPDHcDNA标准品曲线，其线性范围均可达到7个数量级，重组质粒浓度 95．8％。采用以上建立的方法，对莱芜猪背膘脂肪组织进行荧光定量R。r_PcR检测，结果显示，所有样品在荧光定量 R1_PCR检测时都能检测到信号，根据所得A肋J标准曲线方程计算出莱芜猪背膘中ADDlmRNA的具体拷贝数 为Ixl06。 讨论与结论 性RT-PCB等，应用荧光定量RT-PCR技术检测猪ADDImRNA尚未见报道。TaqMan荧光探针法引入了特异性的 探针，利用Taq酶的5’一3’核酸外切酶活性使报告基团和淬灭基团分离，进而检测到荧光信号。可区分特异性和非 Green 特异性的产物，克服了荧光染料SYBR I在此问题上的缺陷，使得检测结果更为准确。荧光信号强度与探针和 特异性片段的结合数成正相关；循环数与PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，因此根据样品 的循环阈值参照标准曲线，经计算机处理后可准确计算出标本内核酸的起始浓度。廉红霞等用荧光定量PCR对猪 曲线的斜率及相关系数显示，研究建立的TaqMan荧光定量R’r-PCR法能够准确检测猪ADDImRNA的表达量，与 传统检测方法相比更为迅速、灵敏。为迸一步探讨ADDI在肌内脂肪沉积中的作用奠定了基础。 关键词：猪；^DD，；荧光定量RT．PCR；TaqMan探针 们感谢魏述东研究员在样品采集方面提供的帮助。 ·通讯作者。E-maih yq跫唱@sdau．edu．cn。 TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪ADD1 mRNA方法的建立与应用 作者： 崔景香， 胡艳霞， 杨伦， 陈其美， 杜金芳， 陈伟， 石元， 祝洪磊， 曾勇床 作者单位： 山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018 引用本文格式：崔景香.胡艳霞.杨伦.陈其美.杜金芳.陈伟.石元.祝洪磊.曾勇床 TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪 ADD1 mRNA方法的建立与应用 [会议论文] 2011