亚胺培南%2f西司他丁、头孢吡肟、头孢曲松与氨曲南对阴沟肠杆菌Amp+C酶的诱导性研究.pdfVIP

盟叠壁鏊盍金塞速 全国照塑蹙鎏：堡噬塞塑：螋迨塞匹缉 一 亚胺培南／西司他丁、头孢吡肟、头孢曲松和氨曲南对 C酶的诱导性研究 阴沟肠杆菌Amp 中国医科大学呼吸疾病研究所(沈阳，110001)王扬夏丽萍康健 随着B内酰胺类抗生素在临床上的广泛应用，革兰阴性杆菌耐药现象日益突出，常常导致感染难以 cp内酰胺酶引起的难治性医 控制，治疗失败，严重威胁着人类的健康。近年来，由染色体介导的Amp 院感染越来越受到关注，它与质粒介导的超广谱口内酰胺酶(EsBLs)被认为是革兰阴性杆菌对第三代头 C JM1群，是由革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑 孢菌素耐药的主要原因。AmpB内酰胺酶属Bush 制的“丝氨酸”头孢菌素酶组成的一个酶家族，对头孢菌素的水解率大于对青霉素类抗生素的水解率。 大部分肠杆菌属如弗劳地枸橼酸杆菌、阴淘肠杆菌、粘质沙雷菌及铜绿假单胞菌可以产生染色体介导的 c酶具有被B内 c酶而对第三代头孢菌素包括头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南耐药。Amp Amp C酶的诱导性进 酰胺抗生素诱导合成的特性。因此，我们的实验就p内酰胺抗生素对阴沟肠杆菌Amp 行研究，以期为预防、控制AmpC酶的产生提供一些参考。 株均以API20E系统进行鉴定。标准菌株E．cloacae029M、029、1194E由北京协和医院惠赠。 (FOX)、克拉维酸(CLA)、头孢唑林。 酰胺；N，N7．亚甲双丙烯酰胺。 4．药敏实验：采用纸片扩散法及E．test试条进行药物敏感性及MIC值检测，药敏纸片包括CRO、头 米卡星(A~Ⅱ()、左旋氧氟沙星(LEV)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。 5．FOX诱导实验：取1 时，加人头孢西丁使其终浓度为实验菌株1／2MIC，37。C摇床上继续孵育2小时，然后提取8内酰胺酶，保 存于一20℃备用。通过测定诱导前、后的酶活性以筛选出野生型、高诱导型及去阻遏型菌株。 6．0内酰胺酶的提取：取1～2个菌落接种于12111l胰蛋白胨大豆胨肉汤中，置于35。C恒温摇床中， 200 000 r／min，4—6小时孵育。将12IId培养液4r／rain离心20分钟，弃上清液。将沉淀一80℃反复冻 000 r／rain 融5次，加入1．5Illl0．Olmol／L磷酸盐缓冲液(pH值7．0)，旋涡混匀，124。C离心1小时，取上 清液经MH琼脂平板常规细菌培养阴性后于一20。c保存。酶提液蛋白定量采用Bradroad测定法。 C酶的诱导性实验：选用不同B内酰胺抗生素，针对FOX筛选出的野生型和高 7．阴沟肠杆菌Amp 诱导型菌株进行Amp 匀后倒入培养皿中，使其终浓度分别达到实验菌株的1／2MIC、MIC、2MIC。再将实验菌株分别接种到含 有上述抗生素的培养基上，放入37。c温箱中持续孵育72h，再接种到MH培养基上多次传代培养，然后 进行8内酰胺酶的提取。 8．口内酰胺酶等电点测定及克拉维酸抑制实验：等电聚焦电泳及染色参照张磊碘染法。克拉维酸 抑制实验：等电聚焦电泳后取下胶板，将1n影J1】l克拉维酸浸泡过的滤纸均匀覆盖于胶板上，放人37。C 温箱中反应10分钟，取下滤纸用碘染法显色。 9．AmpC酶活性测定：在B内酰胺酶粗提液中加入克拉维酸使其终浓度0．1 me／nd，混匀，底物液 (头孢唑啉)在30％水裕中平衡15分钟，取50出酶粗提液加入1．5ml底物液中，混匀，用絮外分光光