酵母三杂交系统在的探究G蛋白信号传导通路中的应用.pdfVIP

酵母三杂交系统在研究G蛋白信号传导通路中的应用’ 鲁宁黄秉仁一 中国医学科学院中国协和医科走学基础医学研究所 国家医学分子生物学重点实验室 北京1000晒 【摘要】 目的：G8亚基可以作为相对独立的结构和功能单位与其效应器蛋白结合而 引发一系列生化反应，但在C舯亚基二聚体中，研亚基的存在可以影响邵亚基的结 构厦其与下游蛋白因子的结合，为了探寻能与晰亚基二聚体相结合的新的蛋白因 子，我们选择了以印和研为饵质粒．具有高灵敏度的研究蛋白问相互作用的酵母 三杂交系统进行研完。方法：利用酵母三杂交体系，分别构建含G岛、c％基因片段的 饵质粒，共转染酵母细胞Y190感受态，筛选人脑cDNA文库；并进一步在哺乳动物细 胞中用免疫共沉淀法对酵母三杂交筛选的阳性克隆进行的鉴定。结果：获得了能与 G船亚基二聚体相结合的新的蛋白因子，并在哺乳动物细胞中验证了这种相互作用； 另外还获得了3条编码能与c肼亚基二聚体相结合的未知蛋白因子的c嗍A序列 中，C鼢亚基二聚体能够通过一些新的蛋白因子参与细胞信号传导。 【关键词】G蛋白；G舯亚基；酵母三杂交系统 GIP结合的调节蛋白(G1Pbi砌rIgpmIein，G pr眦i11)是一类高度保守的七次跨膜蛋白因 子，是最广泛地分布于真核细胞膜的介导信息传导的重要途径，在细胞应答外界刺激并向胞内 传导过程中起着重要作用。这类蛋白由a，B，73亚基组成异三聚体，目前，已发现a亚基有20 种，B亚基6种，7亚基有12种…。长期以来，人们认为G蛋白的特异性由ca亚基决定，而G时 亚基除与％重新结合形成异源三聚体外，并无特异的功能。但自19盯年《自然》杂志上报遭 的第一个由G附亚基激活的效应因子以来，许多的G雕亚基作用的效应器被逐一认识。随着 研究的不断进展，现已发现c蛋白a亚基、B亚基和G附亚基的二聚体都可以相对独立地与各 自不同的效应器蛋白因子相互作用“。1。目前的研究热点之一在于探讨c8和G7亚基在胞内 信号传导中的作用(包括单独和相互间形成二聚体)。已有研究表明，在邵亚基与其效应蛋白 the胁嘲l№nJJal鲥㈣h枷呲0f0Iim 国家自然科学基金重点项目资助sIJp删M (，9630120)； Ca【璐．∞．cn 一80— 因子问相互作用时，口亚基的N端大约100个氨基酸的共有序列具有重要作用；但也有研究提 示G7亚基的存在可以改变印亚基的构型，从而影响邵亚基与下游蛋白因子问的相互作用。 为了探寻能与G舯亚基发生相互作用的蛋白因子，揭示G即亚基在信号传导通路中的作用，我 们利用酵母三杂交系统，对人脑cDNA文库进行了筛选，以期发现相应的蛋白因子。 酵母三杂交系统是在酵母双杂交系统基础之上发展起来的用于检测3个蛋白因子之间的 相互作用，本室建立的酵母三杂交系统可靠、有效nD】，可以用邵，G7为饵质粒进行未知蛋白因 子的筛选，和验证已知蛋白因子间的相互作用。 一、材料和方法 1．菌株和文库 PAcT2质粒文库(购白Clomech公司)。 2．常用试剂及引物 5’ADLD一插入筛查扩增 ⅢA1，DNA分子量标准(协和友谊开发公司产品)；引物：MaIc}lMal【er 弓l物(irIBert 7一cTATI℃GATGATGAAGATAcCccAccA从ccc一3’ Bc陀erliIlg锄曲Ⅱler)5 M砒chMaker3’AD cGGGcTTrr砷：AG1A1℃TAcG LD一插入筛查扩增引物5’一G1略从C11E AT一3’。 3．常规分子生物学方法 法参见《分子克隆》。 4．饵质粒的构建及自身激活鉴定 (1)饵质粒的构建：见本室另文报道…o。 (2)饵质粒自身激活鉴定：将饵质粒分别转化酵母菌Y190感受态细胞，分别涂布于sD， T砷。，sD，np。ze0+选择性培养板上，30℃培养3—4 I丑cz报告基因的表达。