膜蛋白HCV-P7的MAS-NMR的探究.pdfVIP

211 PBl3 膜蛋白HCV-P7的MAS．NMR研究 陈艳可，陶玲，杨俊‘ (中国科学院武汉物理与数学研究所波谱与原子分子国家重点实验室，武汉磁共振中心，武汉430071) 目前丙肝病毒感染了全球3％的人口，导致严重肝病如肝硬化和肝癌的发生。当今的治 疗药物IFN．d和Rib只对50％的患者有效且价格昂贵而难以被患者接受。因此，寻找丙肝 病毒新的药物靶点和抑制剂是当前研究的焦点。P7是一个包括63个氨基酸残基的小疏水蛋 白，定位在内质网膜上，形成亲水型离子通道。其在丙肝病毒释放过程起关键作用【l—J，体 外实验证明该通道对多种抑制剂敏感【3“’5】，是药物筛选的一个重要靶点，吸引了大量研究 者的关注。到目前为止，p7的三维结构及其与抑制剂相互作用的机理尚不明确，这些信息 对药物的筛选以及丙肝的临床治疗都至关重要，因此我们致力于P7的结构生物学研究。由 于磷脂双分子层较去垢剂更接近膜蛋白的天然环境，所以我们选择固体核磁共振方法研究 P7在脂质体环境下的结构和与药物作用的信息。 亲和层析纯化，溴化氰切割移除融合标签，Hiload60／120凝胶过滤，最终每升培养物可获得 单体P7蛋白质3-4mg。样品95％的纯度和毫克级的产量基本满足核磁共振实验的需要。利 用SDS介导，透析移除去垢剂的方法将单体HCV-P7重组到磷脂双分子层 DMPC／DMPG(4：1；w／w)，通过两步离心得到脂质体，即高速离心移除未整合入脂质体的蛋 白聚集体，超速离心收集脂质体。脂质体通过DSP化学交联反应证实p7在磷脂环境可以形 成七聚体，与文献报导相符№】，如图1(B)所示。MAS．NMR采集脂质体一维氮谱检验样品 分辨率，如图2所示。一维15N谱的线宽约为60．90Hz。下一步，我们将优化P7的脂膜重 建过程，以期得到高分辨率的核磁谱图，并最终得到P7结构及其与药物相互作用位点的信 息。 图1HCV-P7纯化和化学交联检测胶图。(A)HCV-P7纯化。 旧 双分子层后化学交联。箭头指向HCV-P7多聚体。 1 SDS—PAGEevidenceof andcrosslinked Figure purified HCV-P7．ArrowHCV-P7 HCV-P7．(A)Purifiedpointed detected resultof protein bySDS．03)Crosslinking 盒塞器罐一 HCV-P7．Arrows of pointed．．different homologouspolymers chemicalcrosslinked SDS—PAGE． HCV-P7，separatedby 图2 CP／MAS DMPC／DMPG(4：1；W／W)／P7样品的一维15N NMR谱。 2 One