嗜碱微生物细胞内氨基酸的高效液相色谱测定及代谢途径分析.pdfVIP

第35卷 分析化学(FENxIHuAxuE)研究简报 第7期 Chinese l008～lOlO 2007年7月 Joumal of矗nal”icdChemistry 嗜碱微生物细胞内氨基酸的高效液相色谱测定 及代谢途径分析 史春云12田晶“’2 高鹏2 许国旺2 (大连轻工业学院，大连116034) 2(中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心，大连116023 摘要建立了嗜碱微生物细胞内17种氨基酸的高效液相色谱分析方法。采用sinochrom0Ds—BP色谱柱， 以乙腈：水=l：l(溶液A)，0．06moL／L乙酸钠溶液+O．1％|】＼『，Ⅳ-二甲基甲酰胺+10％乙腈，用5％醋酸溶 nm。在此色 液调至pH=6．4(溶液B)为流动相进行梯度洗脱，流速0．8mL／min，柱温35。C，检测波长360 谱条件下，各组分在32min内均得到较好分离，回收率符合含量测定要求。运用本方法测定嗜碱微生物发酵 不同时间细胞内氨基酸含量，得到嗜碱微生物细胞内氨基酸在发酵过程中的变化趋势，分析了相关代谢途径。 关键词嗜碱微生物，细胞，氨基酸，高效液相色谱 1 引 言 嗜碱微生物(麟皙∞6∞f∥i“maHm眦玩cMm)属于目前正在探索并未完全开发的新的微生物领域，它 们产生的许多碱性酶已经用于工业规模生产，有着良好的应用开发前景。因此，研究其适应机理和代谢 途径并利用其特殊机能具有重要的理论和实际意义…。 在对发酵液中氨基酸的分析的报道中，对细胞内氨基酸分析的报道相对较少，而嗜碱微生物细胞内 氨基酸的分析尚未见报道。目前，多采用邻苯二甲醛(OPA)法测定氨基酸忙J，但OPA法不能衍生仲氨， 且生成的氨基酸衍生物不稳定，对仪器条件要求较高。本实验采用2，4一二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生 化法，方法预处理稳定，灵敏度高旧J。通过对嗜碱微生物Lp3—3发酵不同时间细胞内17种氨基酸分析， 得到嗜碱微生物细胞内氨基酸在发酵过程中的变化趋势，并简要分析了相关代谢途径。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters2487紫外检测器；uV—2450紫外分光光度 计(日本岛津公司)；FREEzoNE4．5真空冷冻干燥机(美国Labconco公司)；Biofugestratos高速冷冻离 学院微生物研究所；乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，实验用水为Milli．Q高纯水。 2．2培养基制备 发酵培养基制备：葡萄糖50∥L，胰蛋白胨2g／L，酵母膏10∥L，蛋白胨4g／L，K：HPO。2g／L， O．2 40 2 MgS04·7H20g／L，Mncl20．006∥L，NaClg／L，(NH4)2S04g／L，去离子水1L，10％Na2C03调 pH=9。0。 2．3样品的制备 mL的100 2．3．1细胞培养嗜碱微生物Lp3．3活化16h后转接于装液量为50 mL三角瓶中，接种量 2％。于35℃160r／min摇瓶培养，发酵、取样。采用紫外分光光度法，于600nm处测定细胞浓度。 2．3．2细胞内氨基酸的提取和氨基酸衍生细胞破碎及细胞内氨基酸的提取采用文献[4]中方法。 取0．5mL高纯水将干燥的样品复溶，转至衍生瓶中，加入1％2，4一二硝基氟苯(DNFB)．乙腈溶液 2006一lO-15收稿；2007旬2J05接受 本文系国家973计划基金资助项目(No．2003CB716003，2004cB719605) $E—mail：jin鲥鲫0306@hotmail．com 万方数据万方数据 第7期 史春云等：嗜