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表明,在基因表达过程中可以出现一过性的炎症反应。然而对于椎问盘,相
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对隔离的环境使得血循环中的抗体没有机会攻击靶细胞。当然,某种程度
鬟址蟪薹然其它廑剧熏莉《p薹诸薹霎豢奏箍篱鋈萋≤终冀。
上载体的存在也刺激抗体的产生,但这些抗体在数量上还无法对靶细胞发
挥作用!也没有证据表明宿主在组织学上有免疫反应的发生,支持椎间盘
是“免疫隔离区”的观点。椎间盘作为一个相对“免疫隔离区”的概念 已经
被研究了很多年!新的研究结果又进一步地揭示了这一现象可能存在的机
制H9’…。“免疫隔离”的特性在视网膜和睾丸等其它组织已被明确证实是
由于Fas配体(Fas
ligand,FasL)的存在。Fas配体主要是通过诱导有侵袭
能力的Fas阳性的T细胞凋亡,从而限制免疫反应对靶细胞的攻击来发挥
色的细
作用”k52J。Park等H刘在退变椎问盘细胞中已经证实有‰L阳性染
胞存在。Takada【5训在健康完整的椎间盘标本中也证实了FasL阳性细胞的
存在,这些都支持是由于Fas配体的存在,从而使得椎间盘是一个相对的
细胞促合成代谢作用的研究
前 言
椎间盘退变是一系列脊柱退行性疾病的根本病理基础,其结局往往是
椎管狭窄、脊柱节段不稳、骨赘形成、腰腿痛、颈椎病、椎问盘突出及随之而
来的神经根、脊髓受压等等,I临床发病广,病情复杂。尽管目前广泛认为椎
间盘变性是细胞学和生物化学共同作用的结果,但人们对椎间盘变性的机
制并不清楚。细胞学和生物化学变化主要表现为细胞数量的减少和Ⅱ型胶
原、蛋白多糖基因表达产物的下降。随椎间盘变性发生细胞外基质合成下
降,结果导致椎间盘疾病发生。近年随分子生物学发展,例如基因重组和基
因克隆技术发展,可以得到大量的纯基因产物(RNA和蛋白质)应用于试验
和临床工作。应用生物治疗合成蛋白多糖和Ⅱ型胶可原有效的延缓或逆转
椎间盘变性的过程。
hBMP一2是骨形态蛋白家族中的一员,能促进细胞合成代谢。本研究
是探讨不同浓度hBMP一2人骨形态发生蛋白一2腺病毒表达载体(Ad—
治疗椎间盘退变奠定实验基础。
实验材料与方法
1.腰椎间盘细胞分离培养
取成年人腰椎间盘突出症患者手术切除退变椎间盘18个。无菌分离
椎间盘中髓核组织,用剪刀把髓核组织剪成1唧3组织块,组织块在O.2%
胰酶和o.02%Ⅱ型胶原酶消化,细胞在37℃潮湿的含5%co:孵箱中培养,
每周更换细胞培养液2次。
·l·
2.Ⅱ型胶原表达
细胞爬片,采用过氧化物酶标记链霉卵白素进行免疫细胞学染色。
3.aggrecaIl和Ⅱ型胶原表达
100ng/Inl
清液。采用EuSA法定量检测蝽grecan和Ⅱ型胶原表达。
4.aggrecaIl和Ⅱ型胶原mRNA表达
100r影1111hBMP一2,在加入hBMP一2后第6d分别收集培养细胞,反转录聚
合酶链反应检测蝎目recaJl和Ⅱ型胶原mRNA表达。
5.Ad—hBMP一2转染腰椎间盘细胞
待细胞生长至70~80%融合时,更换无血清培养基,根据同等条件下
计数的细胞数加入Ad—hBMP一24h。含20%血清培养基继续培养,检测
指标。
6.转染后椎间盘细胞鉴定
细胞爬片、转染,采用免疫细胞染色检测转染后Ⅱ型胶原表达。待细胞
生长至70~80%融合时,根据同等条件下计数的细胞数加入Ad—hBMP一2
染色体数目。
7.x—gal免疫染色检测转染效率
细胞爬片,待细胞生长至70%~80%融合时,更换无血清培养基,根据
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