载体选择和工程菌构建过程中应注意问题.pptVIP

载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题 一、获取目的基因 二、重组 三、转化 重组和转化需要共同注意的问题 目的基因的稳定性，酶切位点 载体的酶切位点，选择标记 载体的拷贝数，载体和受体的相容性 受体的表达系统 目的菌对密码子的偏爱 四、筛选 五、表达 * * 一、获取目的基因 二、重组 三、转化 反转录法 反转录-聚合酶链反应法 化学合成法 对已发现的基因的改造 载体选择 重组方法 受体细胞的选择 转化方法 方法 四、筛选 五、表达 筛选方法 注意的问题 抗性筛选，蓝白班筛选······ 是否容易产生抗性突变，是否有假阳性 融合表达 包含体表达 分泌型表达 表达方式 目的基因 来源 用途 （决定载体和受体细胞的选择） 克隆 表达 分泌型表达 融合表达 包含体表达 反转录法 反转录-聚合酶链反应法 化学合成法 对已发现的基因的改造 目的基因提取方法 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 M13噬菌体载体 噬菌粒载体 载体 （一）载体的选择 载体 表达型载体：如pUC18/19，pGEM-T载体 克隆型载体：如pBR322，TA载体 （二）重组方法：用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来 1.克隆基因的酶切位点问题 2.载体的酶切问题 3.连接片段浓度比的问题 需要考虑的问题： (1)黏性末端连接； (2)平末端连接； (3)同聚物接尾连接； (4)接头连接法。 （