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可溶性MICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用_临床医学论文 可溶性MICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用_临床医学论文 作者：叶韵斌, 周智锋, 陈 强, 李洁羽, 陈夏, 黄伟炜 【摘要】 目的: 观察乳腺癌患者血清中可溶性MICA（sMICA）表达情况, 探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。方法: ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血sMICA的分泌。流式细胞术（FCM）检测sMICA及白细胞介素15（IL）对NK细胞表面NKG2D表达的影响。MTT法检测NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性。结果: ELISA结果显示, 血清sMICA含量在健康成年人血清中为阴性, 在乳腺良性肿瘤患者血清中含量为（76.8±22.3）ng/L, 在恶性肿瘤患者血清中含量为（205.36±71.27）ng/L, 乳腺癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关。应用含sMICA的血清与NK细胞共培养可明显下调NK细胞的杀瘤活性［（76.2±6.7）% vs （48.4±4.1）%］, NK细胞表面NKG2D表达和上清中IFN分泌量也下降。IL明显上调NK细胞表面NKG2D表达, 增加培养上清IFN分泌量和增强NK对MCF的杀瘤活性。结论: sMICA表达与乳腺癌TNM分期正相关, sMICA通过下调NK细胞NKG2D表达水平而降低NK细胞杀瘤活性, 在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。IL可以上调NK细胞NKG2D的表达并增强NK细胞杀瘤活性。 【关键词】 自然杀伤细胞; 乳腺肿瘤; MICA; NK细胞受体 乳腺癌的病因复杂, 从免疫学发病机制来看, 乳腺癌患者多伴有免疫抑制。NK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞的功能, 但乳腺癌患者NK细胞功能明显降低［1, 2］, 可能是导致乳腺癌发生发展的一个因素。NK细胞功能受激活性受体和抑制性受体的双重作用［3］。相对于抑制性受体, 活化性受体的研究相对滞后, 近年来研究表明活化性受体NKG2D在介导NK细胞的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。MICA为NKG2D最主要配体之一, 许多恶性肿瘤(如肺癌, 胃肠癌, 肝癌, 前腺癌, 多发性骨髓瘤)通过释放可溶性MICA抑制NK细胞的功能［4, 5］。我们通过检测乳腺癌患者血清中可溶性MICA水平, 观察乳腺癌患者血清中可溶性(soluble MHC class I对NK细胞功能的影响, 探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。 1 材料和方法 1.1 材料 NK细胞分选试剂盒购自Meltenyi公司; 鼠抗人CD3单克隆抗体（mAb）FITC、 CD56 mAbPE和NKG2D mAbAPC购自BD公司; sMICA的ELISA检测试剂盒(DY1300) 购自Ramp;D公司; IFNγ的ELISA检测试剂盒购自晶美生物公司; 细胞因子IL15购自Cytolab公司; MTT购自Biomo公司; 培养液RPMI1640和DMEM购自Gibco公司。65例乳腺肿瘤患者来自本院2005-10/2007-01住院女性患者, 均经病理确诊。其中恶性肿瘤49例（浸润性导管癌24例, 髓样癌9例, 浸润性小叶癌9例, 黏液腺癌7例）, TNM分期按1997年国际抗癌联盟标准: Ⅰ期10例, Ⅱ期12例, Ⅲ期9例, Ⅳ期18例; 良性肿瘤16例（纤维腺瘤9例, 囊性增生病4例, 导管内乳头状瘤3例）, 所有患者采集血清前均未进行任何治疗。10例正常对照血清取自健康女性志愿者。乳腺癌细胞株MCF7购自上海细胞所细胞库。 1.2 方法 1.2.1 NK细胞的分选、 纯化及鉴定 参考尹凌凡等［6］方法负向分选纯化NK细胞: Ficoll法分离外周血单个核细胞, 加入生物素标记混合抗体孵育10 min, 离心洗涤, 加入抗生物素磁株孵育15 min, 离心洗涤, 使用德国Meltenyi公司VarioMACS系统过柱, 收集没有标记的细胞即为NK细胞。流式细胞术（FCM）检测分选前后CD3-CD56+细胞的纯度。NK细胞表面NKG2D的检测, NK细胞经CD3FITC, CD56PE, NKG2DAPC 3种不同荧光抗体同时标记, 选择CD3-CD56+的细胞群设门, 测定CD3-CD56+细胞上的NKG2D的表达水平。 1.2.2 MTT法检测NK细胞杀伤功能 设定效靶比为10∶1, 空白组: 培养液; 靶对照组: MCF7细胞+培养液; 效应细胞组: NK细胞+培养液; 实验组: NK细胞+ MCF7细胞。每组设3个复孔, 检测波长为570 nm。杀瘤活性率={［1-（实验组-效应对照组）］/(靶对照组-空白组）}×100％ 1.2.3 血清sMICA的测定 取外周血3 mL于无抗凝干管中, 2 h之内分离血清, -80℃冰箱保存, 根据试剂盒的操作说明书