小鼠B7DC胞外段原核表达载体的构建及表达_临床医学论文.docVIP

小鼠B7胞外段原核表达载体的构建及表达_临床医学论文 小鼠B7胞外段原核表达载体的构建及表达_临床医学论文 作者：樊燕, 江文正, 张亚丽, 闻洁君, 郝文丽, 钱旻 【摘要】 　　目的: 构建小鼠B7胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达。方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（DC）中提取总RNA, 经RT扩增B7胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中, 构建重组表达质粒pET32a(+)。重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS和Western blot进行检测。结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7胞外段基因, 经测序证实其序列正确。SDS和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41000的B7胞外段蛋白。结论: 成功地构建了小鼠B7胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7的功能奠定实验基础。 【关键词】 B7 DC 基因克隆 原核表达 　　[Abstract] AIM: To construct a prokaryotic expression vector for the extracellular domain of murine B7nt of B7DC cDNA was amplified by RTPCR. The recombinant plasmid pET32a(+)B7DCECD was constructed by cloning the extracellular fragment of B7DC cDNA into the prokaryotic expression vector pET32a(+). After the recombinant plasmid was identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing, pET32a(+)B7DCECD was transformed into E.coli BL21 through IPTG induction to express the target protein, and the protein was analyzed by SDSPAGE and Western blot. RESULTS: A 582 bp of extracellular fragment B7DC cDNA was obtained and the sequence was confirmed right by DNA sequencing. SDSPAGE and Western blot analysis showed that a protein with molecular weight of 41 000 was expressed in E.coli BL21. CONCLUSION: The extracellular fragment of B7DC is successfully cloned into pET32a (+) and expressed in E.coli BL21, which lays a foundation for the further functional research of B7DC. 　　[Keywords]B7 　　T细胞的活化需要双信号系统: 一是TCR与抗原肽复合物的相互作用; 二是共刺激分子所提供的协同刺激信号。B7家族作为惟一能从抗原提呈细胞单向传送信号至T细胞的共刺激分子[1], 已逐渐成为当今免疫学研究的一个重点领域。B7（PD）作为B7家族的第5个成员, 是Tseng等[2]在2001年研究树突状细胞（DC）和活化的巨噬细胞基因差异表达中被发现的。鼠类的B7基因位于第9号染色体上, 其cDNA全长约为1700 bp, 相对分子质量（Mr）约25000, 可编码247个氨基酸。B7选择性表达于DC上, 骨髓和脾来源的成熟或未成熟的DC均可表达B7。B7与PD以配体受体的形式结合, 不仅在T细胞活化的过程中提供负调节信号, 而且在自身免疫性疾病的发生、 维持机体的外周耐受和肿瘤免疫方面发挥重要的作用[2, 3]。为此, 我们构建鼠B7胞外段原核表达载体, 并在E.coli BL21中表达, 为今后研究B7的功能奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 BALB/c小鼠（6～8周龄）购自中科院上海实验动物中心。EcoRⅠ、 XhoⅠ、 T4 DNA连接酶和RT试剂盒均购自TaKaRa公司。