小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备_临床医学论文.docVIP

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备_临床医学论文 小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备_临床医学论文 作者：鲍俊峰, 王胜军, 马洁, 崔大伟， 杨先知， 毛朝明, 仝佳, 邵启祥, 许化溪 【摘要】 目的： 体外原核表达小鼠Foxp3蛋白，并以其免疫家兔，制备多克隆抗体。方法： 从质粒Foxp3扩增小鼠Foxp3 全长基因，亚克隆至原核表达载体pET，转化E.coli BL； IPTG诱导表达目的蛋白，Ni2+柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白；纯化蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹检测抗体特异性。结果： 成功构建了Foxp3原核表达载体，表达和纯化了目的蛋白；ELISA法检测抗体效价为1∶20 000，蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论： 成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。 【关键词】 Foxp3； 原核表达； 多克隆抗体； 小鼠 　　［Abstract］ Objective: To prepare rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein by prokaryotic expression of mouse Foxp3 protein in vitro. Methods： Foxp3 gene was amplified by PCR from the full length plasmid Foxp3ombinant protein was induced by IPTG. after purified with Ni2+NTA column, identification of the recombinant protein by Western blot was performed; the purified protein was used as antigen to immunize rabbits, the titer and the specificity of the rabbit antiFoxp3 antibody were detected by ELISA and Western blot, respectively. Results： The prokaryotic expression vector for Foxp3e Foxp3 protein was prepared, the titer of the antibody was 1∶20 000 by ELISA and Western blot analysis showed that the polyclonal antibody could specifically recognize mouse Foxp3 protein. Conclusion： Mouse Foxp3 protein had been expressed and rabbit antiFoxp3 antibody had been prepared successfully. 　　［Key words］ Foxp3; prokaryotic expression; polyclonal antibody; mouse 　　FOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子家族，通常和细胞生长发育的调控有关［1］。Foxp3蛋白是叉头样转录因子家族中的成员， 2001年由Brunkow等［2］首次报道。小鼠Foxp3基因位于其X染色体，全长为3 739 bp(包含5′端非编码的外显子)，其基因编码的蛋白质也称为Scurfy，由429个氨基酸组成，N末端有锌指蛋白、亮氨酸拉链和一个富含脯氨酸的区域，而叉头样DNA 结合域与其他FOX成员不同,靠近蛋白C末端［3］。Foxp3在小鼠特异性表达于CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory T cells, Treg细胞)而不表达于CD8+T细胞，研究发现，Foxp3作为Treg细胞发育的一个关键转录因子，它的表达及功能与Treg细胞密切相关［4］，可以更好地在分子水平上了解Treg细胞。 　　本实验室已经构建小鼠Foxp3/AAV表达载体［5］，在此基础上我们构建原核表达载体Foxp3pET32a，IPTG诱导表达重组蛋白，并进行纯化。利用纯化的Foxp3蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，为研究小鼠Foxp3蛋白对Treg细胞的功能影响提供基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材 料 　　1.1.1 主要试剂 Ex Taq DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、dNTP，T4DNA连接酶、蛋白标