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小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用_临床医学论文 小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用_临床医学论文 作者：尹辉, 龚权, 杨衡, 熊平, 郑芳 龚非力 【摘要】 目的: 克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒, 初步探讨其表达产物sST2融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响。方法: 借助RT技术, 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA, 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体（psST2）。应用脂质体将重组质粒psST2转染CHO细胞, 经G418筛选, 获得稳定表达sST2融合蛋白的CHO细胞株。细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后, 采用Western blot进行鉴定, 应用FACS检测sST2与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况; ELISA法检测sST2对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF和IL的影响。结果: 测序证实克隆和构建的小鼠sST2阅读框序列正确, Western blot 证实sST2融合蛋白的表达, sST2抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF和IL。结论: 成功构建sST2融合基因并获得稳定表达, sST2通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应。 【关键词】 小鼠sST2真核表达; RAW264.7; TNF ST2 最早被认为是由成纤维细胞分泌的一种血清免疫应答产物, 随后发现肥大细胞［1］和Th2细胞［2］表面存在一种跨膜型ST2, 但其不表达在Th1细胞表面。目前证实ST2属于IL受体超家族成员, 但不能与IL家族成员IL、 IL或IL拮抗剂结合。由于在mRNA水平剪切方式的差异, ST2基因表达产物以跨膜型（ST2L）和分泌型(sST2)两种形式存在, 前者主要分布在源于造血细胞的细胞表面如肥大细胞和嗜酸性粒细胞, 而后者主要由成纤维细胞分泌产生。近来研究显示, ST2除了诱导免疫应答由Th1型向Th2型偏移, 还涉及到类风湿性关节炎、 过敏性哮喘等多种疾病的发生发展［3, 4］。我们通过构建小鼠sST2人IgG1 Fc重组质粒（psST2）并表达可溶性ST2融合蛋白, 观察其对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞生物学活性的影响, 为进一步应用该分子治疗炎症相关性疾病奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 BALB/c小鼠(8～12周龄, 雄性)由湖北省医学实验动物中心提供; CHO细胞购自中国典型培养物保藏中心; RAW264.7巨噬细胞由华中科技大学同济医学院免疫学系保藏。单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体购自Ramp;D公司。LPS和人IgG标准品购自Sigma公司, TRIzol试剂和脂质体LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司, RT试剂盒购于MBI公司。各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司。Sepharose CL蛋白A亲和层析柱购自Amersham Biosciences。DNA合成和测序由Invitrogen (上海)完成。 1.2 方法 1.2.1 重组表达载体的构建 采用TRIzol试剂提取BALB/c小鼠脾细胞总RNA, 经RT扩增全长sST2 cDNA。PCR 引物的序列为: 5′和5′C AAT GTG TGA GGG ACA CTC CT3′。采用Hind III和BamH I分别双酶切sST2和载体pcDNA3.1将酶切片段sST2插入pcDNA3.1载体Fc的上游, 构建重组表达载体psST2转化E.coli DH5α宿主菌, 筛选阳性克隆, 经酶切和测序鉴定。 1.2.2 转染与筛选 用QIAGEN质粒试剂盒提取重组表达载体pcDNA3.1采用脂质体LipofectamineTM 2000转染CHO细胞, 同时转染空载体pcDNA3.1和未转染细胞作为阴性对照。具体方法为: CHO细胞在含100 mL/L胎牛血清的DMEM中, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度下培养。转染前1 d, 细胞用2.5 g/L胰酶消化并接种于24孔培养板中（细胞数为1×105/孔）, 待细胞融合至70％～80％时, 按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行转染, 并设空载体和未转染组对照。培养48 h后, 加入G418(800 mg/L)筛选阳性抗药克隆。 1.2.3 sST2蛋白的纯化及鉴定 收集细胞培养上清用Sepharose CL蛋白A亲和层析柱纯化sST2融合蛋白, 纯化样品的浓度用A280吸收法测定。采用Western blot鉴定sST2蛋白表达, 一抗为单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体, HRP标记的兔抗大鼠为二