小鼠基质金属蛋白酶9 RNA干扰慢病毒载体在体外的沉默效应_临床医学论文.docVIP

小鼠基质金属蛋白酶干扰慢病毒载体在体外的沉默效应_临床医学论文 小鼠基质金属蛋白酶干扰慢病毒载体在体外的沉默效应_临床医学论文 【摘要】 目的 探讨构建的小鼠基质金属蛋白酶(MMP)干扰(RNAi)慢病毒载体在体外工具细胞中的沉默效应。方法 针对小鼠MMP基因序列构建的MMP过表达克隆质粒和RNAi慢病毒载体共转染培养良好的工具细胞(293T和NIH3T3细胞)，采用实时荧光定量PCR和Western印迹观察RNAi对工具细胞中MMP和蛋白表达的下调作用。结果 构建的MMP慢病毒载体能显著降低工具细胞中MMP9表达量。结论 成功构建了能够抑制小鼠MMP表达的RNAi慢病毒载体，为在体研究奠定了基础。 【关键词】 基质金属蛋白酶干扰;慢病毒载体 　　【Abstract】 Objective To explore the silencing effect of the constructed mice′s matrix metalloproteinase (MMP) and NIH3T3 cells were cocultured by MMP9 overexpressed clone plasmid and RNAi lentivirus vector. Real time PCR and Western blot were adopted to observe the downregulation of MMP9 mRNA expression in 293T and NIH3T3 cells by RNAi. Results The constructed MMP9 RNAi lentivirus vector significantly decreased MMP9 expression in 293T and NIH3T3 cells. Conclusions RNAi lentivirus vector inhibiting MMP9 expression is successfully constructed, laying foundation for the research in vivo. 　　【Key words】 Matrix metalloproteinase (MMP) 　 动脉粥样硬化(AS)斑块破裂是急性缺血事件的主要原因。细胞凋亡和基质降解机制与斑块破裂过程有关〔1〕。循环中细胞外基质(ECM)标记物的水平常常与AS疾病的危险分层密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)降解ECM，破坏动脉壁的完整性，触发急性动脉血栓形成〔2〕。MMPs是与ECM蛋白质降解密切相关的蛋白水解酶，在组织重塑过程中起重要作用〔3〕，是造成AS斑块不稳定的重要原因之一。不稳定的人AS斑块局部MMPs的主要来源为单核细胞/巨噬细胞，而MMPs的主要成分是MMP和〔4〕。因此，抑制MMP在不稳定斑块中的表达，可能抑制斑块破裂。为此，本实验构建小鼠MMP干扰(RNAi)质粒，采用Western印迹和实时荧光定量PCR法，验证MMP干扰质粒在工具细胞中的沉默效应，为进一步在体研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 由上海吉凯基因有限公司构建合成并包装的MMP慢病毒载体;DMEN、胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶(上海化学试剂公司);Lipofectamine2000、Trizol(美国Invitrogen公司);兔GFP多克隆(Abcam公司);山羊抗兔IgG公司);预染的蛋白标志物(中晶公司);荧光显微镜(Olympus公司);实时荧光定量PCR仪器(BioRad公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 Western印迹检测293T细胞中MMP表达 将构建好的MMP基因过表达克隆质粒和针对不同靶点RNAi病毒载体质粒，共转染入293T细胞，于转染后72 h，收集培养上清行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%脱脂奶封闭过夜;用含5%脱脂牛奶的TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物酶驴抗小鼠二抗(1∶4 000)，于室温下孵育2 h，用Amersham公司ECL+plusTM Western印迹试剂盒检测蛋白表达。 　　1.2.2 实时荧光定量PCR检测NIH3T3细胞中MMP的表达 NIH3T3细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，分为正常对照组、阴性对照组和RNAi组。MMP基因引物采用Beacon designer 2软件设计，上游引物：GGCGTGTCTGGAGATTCG，下游引物：TACTGGAAGATGTCGTGTGAG;分别取转染后的NIH3T3细胞，按Invitrogen公司的Trizol操作说明