小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)FGFR1的构建及表达_临床医学论文.docVIP

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)的构建及表达_临床医学论文 小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)的构建及表达_临床医学论文 作者：郭峻莉，翁志宏，郑少江 【摘要】 目的：通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)，并检测其在CHO细胞中的表达。方法: 通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA, 应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒, 经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后, 用脂质体包裹转染CHO细胞，Western blot 检测FGFR1目的蛋白的表达。结果：经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确, 该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论：成功构建的pcDNA3.1(+)重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。 【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子1型受体(FGFR1);真核表达质粒;基因工程 　　View from specialist: It is creative, and of certain scientific and educational value. 　　[ABSTRACT] Objective: To construct a recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (+) the recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysed and sequencing test, it was transfected into eukaryotic cell CHO by lipofectin. The FGFR1 protein was explored by Western blot. Results: The constructed recombinant plasmid contained the sequence of FGFR1 gene. After transfection with the plasmid, FGFR1 protein can be expressed in CHO cells. Conclusion: The constructed eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (+)FGFR1 can effectively express FGFR1 protein in vitro. 　　[KEY WORDS] Fibroblast growth factor receptor 　　现已证实，实体肿瘤的生长与转移必须依赖于血管生成[1,2]。碱性成纤维细胞生长因子1型受体(fibroblast growth factor receptor1，FGFR1)是最重要的肿瘤血管生成调节因子之一，其主要通过与高亲和性配体bFGF结合后发生二聚体化导致自身磷酸化，从而诱导肿瘤血管生成，进而促使肿瘤细胞增生和转移[3-5]。 可见，FGFR信号传导通路在肿瘤血管生成中扮演着重要作用。许多研究表明，利用DNA核酸疫苗可以诱导产生交叉免疫反应抗肿瘤血管生成[6-8]。我们新近研究也证实，以FGFR1基因为靶点的生物治疗可以抑制肿瘤血管生成达到治疗肿瘤的目的[9-11]。因此，本研究拟利用基因工程技术构建小鼠FGFR真核表达载体，为后继研究FGFR1的医学应用奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 质粒和宿主菌 真核表达质粒pcDNA 3.1 (+) 购自 Invitrogen公司，宿主大肠埃希杆菌E. coli DH5α和CHO 细胞株为本实验室保存。 　　1.1.2 酶类及试剂 Trizol、转染试剂盒LipofectamineTM2000 购自Invitrogen 公司，一步法RT试剂盒、DNA marker、限制性内切酶和T4 噬菌体DNA 连接酶购自TaKaRa公司，胎牛血清购自Gibcol 公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG 购自Santa Cruz 公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 目的基因片段的体外扩增 根据GenBank中小鼠FGFR1基因全序列设计扩增其全长基因序列的引物。 经引物设计软件Oligo6.0评价，设计的引物符合要求，没有破坏FGFR1基因的阅读框架。上游引物：5′，下游引物：5′AAT CAG CGC CGT TTG AGT CCA C 3′，引物由上海基康生物技术有限公司合成。在上、下游引物的5′端分别加入限制性核酸内切酶Bam HI 和 XhoI酶切位点。在梯度PCR仪上进行扩增，获得小鼠FGFR1全长基因片段(产物为2201 bp)。PCR