第三章酶的分离与纯化-----副本.ppt

步骤 step 总体积 Volume (ml) 总活力 Total activity (u) 总蛋白 Total protein (mg) 比活力 Specific activity (u/mg) 纯化倍数 Purification (fold) 收 率 Yield (%) 粗酶 1040 460070 168.1 乙醇沉淀 90 142574 10.9 DEAE-Sepharose柱层析 11 46629 2.0 HiTrap-Q柱层析 19 42218 0.3 下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。 小 结 1、酶的分离纯化策略 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的纯化方法 5、酶的浓缩、干燥与结晶 思考题 1、简述酶沉淀分离的主要方法及其原理。 2、何谓膜分离技术？在酶的生产中有何应用？ 3、简述双水相萃取及反胶束萃取的概念与特点。 4、试述凝胶层析的原理和操作要点。 5、为什么SDS-凝胶电泳不受蛋白质分子所带电荷及分子形状的影响？（P124） 6、酶纯化方法的选择依据有哪些？ 7、简述酶纯化工艺次序的选择策略。 思考题 8、试论述如何利用本章所学的各种分析技术对特定的蛋白酶进行酶学性质（如分子质量、pI、带点状态、亚基组成、溶解性等）研究。 9、脂肪酶（在食品加工、洗涤剂和造纸等诸多领域有着广泛的应用。黑曲霉脂肪酶因其具有良好的生物安全性，一直是传统食品加工中的重要食品添加剂。现在分离到一株脂肪酶高产菌株，经鉴定为黑曲霉。利用所学的知识，试设计一套从黑曲霉发酵液中纯化脂肪酶的方案。 * * * * * * * * * * * * * * * * 上节课主要内容 酶分离纯化的方法 1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 复合沉淀法 选择性变性沉淀法 差速离心 密度梯度离心 等密度梯度离心 粗滤 微滤 超滤 纳滤 反渗透 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 层析聚焦 凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示： Ve-Vo Kd=———— Vi Vo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml） Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml） Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml） 凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰 Ⅰ. Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。 Ⅱ. Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。 Ⅲ. 其它组分0Kd1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。 Ve-Vo Kd=———— Vi 分配系数Kd的意义： 1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。 2) 判断分离效果，Kd差异大，分离效果好， Kd差异小，分离效果差。 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 凝胶型号 颗粒大小/μm 溶胀体积/(ml/g) 分离范围（Mr） Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Sephadex G-50 Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 4～120 4～120 50～150 50～150 40～120 40～120 40～120 40～120 2～3 2.5～3.5 4～6 9～11 12～15 15～20 20～30 20～30 小于7×102 小于1.5×103 1.0×103～5.0×103 1.5×103～3.0×104 3.0×103～8.0×104 4.0×103～1.0×105 5.0×103～3.0×105 5.0×103～6.0×105 型号 使用范围（蛋白质的分子量） 含琼脂糖（℅） ? 6B Sepharose 4B 2B 104～3×106 105～3×107 106～108 6 4 2 ? 6B Sepharose CL 4B 2B ? 同上 同上 ?