第六章重组体的筛选与鉴定-.ppt

（2）Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 Western装置 ② Blotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶：HRPO 1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 ③ Blotting过程 Immuno Blotting ④结果 多克隆抗体Blotting的结果 单抗blotting结果 转译筛选法有两种:杂交选择转译（hybrid selected translation,HART)杂交抑制转译(hybrid arreated translation,HRT)。 转译筛选法的突出优点是将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。 第六节 转译筛选法 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 一、无细胞翻译系统 无细胞系统 cell-free system 指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽取物。无细胞系统要包含以下成分：核糖体、各种tRNA、各种氨酰-tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止释放因子、GTP、ATP、20种基本的氨基酸。常见的无细胞翻译系统有：大肠杆菌无细胞翻译系统、兔网织红细胞无细胞翻译系统、麦胚无细胞翻译系统和某些肿瘤细胞制备成的无细胞翻译系统。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 Southern blot 筛选结果 （1）原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。 （2）R-环检测法 DNA-RNA杂交。 1）原理： 2）选择过程 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。 缺点：需要电镜！ 2. Northern blotting 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 主要检测插入片断是否被转录。 从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。 第五节 免疫化学检测法 在某些情况西下,如待测的重组克隆子既无任何可供选择的基因表型特征,又无理想的核酸杂交探针时,可以考虑采用免疫化学检测法. 抗体检测法 免疫沉淀检测法 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式： 一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 2. 放射性抗体检测法过程 3. Broome-Gilbert双位点检测法 质粒基因A 插入基因B 表达 质粒蛋白A 外源蛋白B 融合蛋白 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 固相支 持滤膜 抗A抗体 125I标记的 抗B抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 质粒蛋白A 外源蛋白B 固相支 持滤膜 抗A抗体 发光，底片曝光 二、免疫沉淀检测法 1. 原理 检测目的基因相对应的标记抗体。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 2. 优缺点 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能