第章分子生物学研究方法上.ppt

化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) * * 5.6.2 蛋白质印迹法 分子生物学中最常用的蛋白质技术可能是蛋白质印迹法 （Western bloting），又称免疫印迹法（immunobloting） 原理：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 5.6 蛋白质组与蛋白质组学研究技术 * * 蛋白质印迹法 用于二级抗体的检测有 以下三种： 放射性标记的抗体 与酶偶联的抗体 与生物素相偶联的抗体 5.6 蛋白质组与蛋白质组学研究技术 蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定电泳后分离的蛋白质。 该技术是一种超灵明的技术，从理论上说，仅需少量样品就可获得错误率低于百万分之一的结果。 5.6 蛋白质组与蛋白质组学研究技术 5.6.3 蛋白质质谱分析技术 * 转导是通过缺陷phage来传递DNA片段，转染是提纯的病毒核酸侵染细胞后能产生正常病毒的现象。转化是受体菌直接接受拱体菌DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。  * 将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。 因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码?-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型?-半乳糖苷酶实现基因内互补（ ?-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为?-互补现象。 * pUC 质粒带有大肠杆菌 lac 操纵子的一段DNA（Lac Z） Lac Z编码 ?-半乳糖苷酶氨基端一个片段，并与宿主大肠杆菌 gal– 基因互补 当pUC 质粒转化到合适的gal– 大肠杆菌后，在含有诱导物 IPTG（ 异丙基 ?-D 硫代半乳糖苷）和显色底物X- gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷）的培养基上形成蓝色菌落 当外源DNA片段克隆到pUC质粒的这一区段时， Lac Z 基因失活。这种重组质粒转化到同样的gal– 大肠杆菌后，在含 IPTG和 X-gal 平板上形成白色菌落44 * * * * * * * * * * 基因组文库(gene library)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。 一是SNP数据库的构建，主要目的是发现特定种类生物基因组的全部或部分SNP；二是SNP功能的研究。大规模SNP数据库构建只是基因组序列分析中心可以胜任的工作，常规实验室是不太可能进行该工作的。但我们应该注意到，发现SNP只是SNP研究的第一步，而SNP功能的研究才是SNP研究的目的。染色体DNA特定区域的SNP的功能研究是很多分子和细胞生物学实验室可以进行的工作。特定DNA区域的特定SNP在特定群体的序列验证和频率分析以及SNP与特定生理/病理状态关系的研究是SNP研究的主要方面。 SNP 检测方法的发展趋势 一个理想的检测SNP 的方法必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百到上百万个样品。 介绍的目的，开阔思路，了解一些比较新的方法，由于时间的原因，传统的方法我就不详细介绍了。 * 生物体之所以能表现出各种各样的特性，展示出丰富多彩的表型，主要是由于其内部基因表达的差异所致，因此认识生物体内部基因有序地、时相性地表达是揭示遗传信息复杂性的一个极为重要的步骤