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HCV变异的血清学检测技术的初步研究 张向颖1 修冰水2 王国华2 凌世淦2 宋晓国2 冯晓燕2 何 竞2 陈 坤2 柴文涵2 朱翠霞2 张贺秋2 1．中国药品生物制品检定所，北京。100050 2．军事医学科学院基础医学研究所，北京，100850 HCV整个基因组呈高度变异，其中位于HCVPCR产物回收试剂盒由华舜生物工程有限公司生 包膜蛋白E2N端的27个氨基酸变异最大，故命名 产。 为第一高变区(HVRI)。HVRl含有中和性抗原表1．3仪器及血清标本PCR扩增仪为PE公司 位，许多学者认为，丙型肝炎病毒通过HVRl抗原 PCR 生产的Gene-Amp 的变异形成新的准种，新准种逃避宿主的免疫监测， 血清由北京红十字血液中心、北京人民医院肝病研 造成患者的持续感染。 究所提供。 大量研究显示HVRl准种的复杂程度的高低 2．方法 与HCV慢性化进程有密切相关，其中慢性肝病变 2．1HVRl序列的筛选及克隆 期、肝硬化HCV患者体内准种的复杂程度要显著 采用自编VB程序建立国内外HVRl序列数 据库，进行同源比较，据此进行分组后，并筛选每组 高于无症状期；而HCV变异程度高的患者，IFN的 治疗效果应答率低，因此。对HCV变异的检测涉及 中的HVRl代表序列，即与组内其它序列相似度最 HCV疾病的转归及疗效的预测，具有十分重要的临 高的序列。分别采用大肠杆菌优势密码子合成上述 床意义。 代表序列的基因，进行克隆表达纯化。分别包被酶 尽管HCV基因克隆测序法为变异检测的最直 联版，检测每条抗原与HCV—HVRl阳性血清参考 接的方法，但考虑到测序工作量大且成本高，目前对 品的反应活性，筛选其中具有准毒株特异性的 HCV变异的研究主要采用单链构象多态性分析 HVRl抗原。 2．2多靶点HVRl检测芯片制备 (SSCP)，通过对PCR产物的变性复性对基冈变异 进行分析，但该技术仍然需要进行RNA提取、RT— 采用点接触法制备芯片，用Cy3荧光二抗显色 PCR等过程，无法普遍应用于临床。故本研究通过 法检测并统计每份HCV感染者血清与多靶点 对大量HVRl序列的筛选，获得具有准种代表意义HVRl抗原阳性反应数目，作为评价HCV变异高 低的标准。 的HVRl抗原，制备HCV变异的多靶点检测芯片， 并通过对患者体内变异HVRl抗体的检测，初步建 2．3SSCP法的建立 立以血清学检测为基础的HCV变异检测技术。 GAT 了HVRl巢式引物。分别是：外l：TGG 材料和方法 GAA ATGATGATGAACTGGTC外2：AAT 1．材料 TTCTACAACAGGGCTTGGGA内1：GCC CCA ATG 1．1菌株质粒HBl01用于质粒的克隆与扩TTGCCTACTATT TG内2：TTG TGCCAACTGCCATT，通过RT—PCR的方法扩 增，