蓖麻毒素寡核苷酸适配子的CE-SELEX筛选的研究.pdfVIP

蓖麻毒素寡核苷酸适配子的CE．SELEX筛选研究 廑直墨，谢剑炜! (军事医学科学院毒物药物研究所100850北京) SELEX“2。3技术是一种新的组合化学技术，应用人工合成的随机寡核苷酸文库，通 过筛选、分离、富集获得能与氨基酸、蛋白、药物、有机小分子、无机离子等靶物质特 异性结合的寡核苷酸适配子，且具有高亲和力。相比大分子的抗体，寡核苷酸适配子分 子量小，结构简单，能保证合成的精确性以及易连接其它分子进行修饰，如荧光素、生 物素等。同时，应用寡核昔酸适配子还能克服小分子等物质免疫原性弱，难以产生抗体； 寡核苷酸适配子可以变性、复性且速度快，可反复使用、长期保存。基于寡核苷酸适配 子的这些优点，将适配子作为生物传感器的识别元件，制成适配子生物传感器 (Aptasensors)，具有不可替代的优势。 本文将毛细管电泳技术作为分离手段引入到SELEX筛选中，建立了一种全新的 CE·SELEX4筛选模式。这种筛选方法充分利用了毛细管电泳的高效分离能力的特性，极 大地提高了筛选效率，使得传统的SELEX筛选方法需要耗费数个星期，至少进行8一15 轮的筛选缩短为整个筛选只需数天即可。在本实验中，我们体外构建了含40个随机序列 全长87nt的随机ssDNA文库，采用线性聚丙烯酰胺凝胶内涂层的毛细管用作对蓖麻毒索 寡核苷酸适配子筛选分离，仅数天四轮的筛选即得到了特异识别蓖麻毒素蛋白的富集文 库(图1、表1)。克隆、测序得到了1l条适配子全序列，并用同位素标记法测定了其中 3条序列与蓖麻毒素蛋白的亲和力(表2)。这为下一步研制特异识别蓖麻毒素的适配子 生物传感器奠定了基础。 口 i ● ‘ s 1口 Timq(mi∞ oftheDNA observedCE-SELEX Figurel．Electropherograms selection．The pool during ssDNA WaS incubatedwith ricinatroom for pool 10pmol 30minandthemixture temperature +通讯联系人：谢剑炜，E-mail：xiejw@rile．brnJ．∞．cn 42 conditions：thebuffer,20mlVl for5s．CE were by 50mbar running applying samplesinjected KCI，ImM ImM anddetection HEPES NaCl，5mM CaCk，andMgClz；一10kV pH7．1，40raM wavelength，254nm． 里生!!!：!!里里!型!!曼里：!里三=呈茎!!!!!!!!!!!!曼里!!堕 riein to round ％Bound and Selection ssDNA(pm01)Inputricin(pra01) Input