AIDS患者中常见分支杆菌机会感染快速检测方法地研究.pdfVIP

AIDS患者中常见分支杆菌机会感染快速检测方法的研究 王洪生李晓杰吴勤学+崔盘根刘训荃 中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所南京210042 摘要 目的：建立敏感、特异的快速检测AIDS患者中机会感染率较高的四种分支杆菌感染的方法。 方法：(1)用特异性引物对结核分支杆菌(Mycobacterium (Mycobacteriumavium，Ma)、细胞内分支杆菌(Mycobacterium kansasii，Mk)菌悬液DNA进行PCR扩增，验证其敏感性和特异性； (Mycobacterium (2)将上述四种分支杆菌的特异性引物同时放入PCR扩增反应体系中，以此反应体系分别对该 四种分支杆菌菌悬液DNA、菌悬液DNA的两两组合以及结核分支杆菌、鸟分支杆菌和细胞内分支 杆菌菌悬液DNA三重组合进行扩增，同时验证其敏感性。 结果：四种分支杆菌的特异性引物分别放入各自的PCR扩增反应体系中可分别特异性地扩增出 性引物同时放入同一PCR扩增反应体系中可分别特异性地扩增出对应的四种分支杆菌单菌及其两两 X 组合和兰种分支杆菌组合的DNA片段，敏感性达110：～I×10，个菌细胞／mL；四种分支杆菌的 特异性引物对其它分支杆菌进行扩增，结果均为阴性。 结论：多重PCR方法能敏感、特异地快速检测AIDS患者中机会感染率较高的四种分支杆菌单 独或混合感染。 关键词：分支杆菌 结势 黾 细职户 堪6秒 聚合酶链反应 多手 有研究报告高达25％一50％以上的AIDS患者并发分支杆菌感染，主要是结核、鸟．细胞内复合体 及堪萨斯分支杆菌等感染。抗酸菌镜检、培养及生化鉴定方法虽很有用，但其敏感性低，耗时多(培 养平均4周，鉴定需2～4周)，不能完全适应临床需要；当AIDS合并分支杆菌感染，待按传统方法 诊断到种的水平之前病人的治疗可能被不可挽回地延误。这一现象引起了人们对如何快速、准确地 诊断AIDS患者是否并发分支杆菌感染这一问题的密切关注。我们用相关标准分支杆菌菌株建立了快 速、敏感、特异的检测方法，报告如下。 材料与方法 一、菌株来源及培养 avi 标准菌株鸟分支杆菌(M um)、胞内分支杆菌(Mi ntracellulare)、瘰疬分支杆菌 chelonae) bovis)、 耻垢分支杆菌(M 适生长温度分别放于32℃和37℃培养。 二、细菌计数及DNA的释放 收集丰富生长的细菌，无菌操作，加适量无菌蒸馏水，用组织研磨器研磨，制成细菌悬液；取 少量细菌悬液涂片、抗酸染色后计数，计算出浓度。采用冻融法提取细菌DNA，即液氮冷冻lmin， 沸水煮沸1min，反复5次，其中最后1次煮沸10min，离心后取上清，．20(2保存备_l{j。 三、结核、鸟和细胞内及堪萨斯分支杆菌标准菌株的多重PCR扩增方法的建立及其敏感性、特 异性检测 1．PCR扩增：参照文献设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如表1。 表1 4种分支杆菌的特异引物 u PCR反应体系1(单对引物单模板)：含10×PCR缓冲液5L，25mM 5 u L．dNTPsl MgCl2 u u u L，上下游引物各1 L(共2L)，模板DNA5 la 68． uL。 X u 5 u PCR反应体系2(多对引物单模板)：含10PCR缓冲液5