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PCR技术与方法 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR): 1983年美国Mullis等发明了PCR技术，可在几小时内将DNA片段扩增109倍，具有特异性、高效率、忠实性. PCR基本原理和影响因素 一、PCR基本原理 PCR是一种快速和简便的DNA体外扩增技术。在模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下，利用耐热DNA聚合酶进行聚合反应，经变性、退火及延伸三步骤多次循环，对特定DNA模板进行扩增。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 PCR扩增靶DNA示意图 双链靶DNA 例1：PCR反应步骤 PCR反应体系的组成及作用 组成PCR反应体系的元素主要包括 模板核酸、 引物、 TaqDNA聚合酶、 缓冲液、Mg2+、 三磷酸脱氧核苷酸（dNTP)等 （一）模板（template) DNA或 RNA cDNA 含40%G-C, Tm ~87o C 含60%G-C, Tm ~95o C PCR 90~96o C 可来源于各种标本 临床标本，法医学标本 病理标本，考古标本等 引物 (primer) 引物是与待扩增核酸序列两端的已知序列互补的寡核苷酸片段 例：上游引物，下游引物 5’CTGATACGTACGAT………GCAGTTAGATGT3’ 3’……ATCTAC5’ 5’GATACG……3’ 3’GACTATGCATGCTA………CGTCAATCTACA5’ 引物设计原则 提高特异性扩增，抑制非特异性扩增 引物与模板的特异性结合 多聚酶对引物的有效延伸 引物设计原则 2.引物的3`末端和5`末端核苷酸 引物3`末端是PCR延伸的起始点，不能有错配，否则影响特异性。引物3`端尽量避免碱基A和作为密码子的第三个碱基。3`末端不能进行修饰。 引物设计原则 3.GC的合理含量： 引物设计原则 4.避免引物自身和引物之间的互补 一般单个引物自身连续互补碱基不能超过3 bp，一对引物间也不宜多于4个连续碱基的互补，尤应避免3’端的互补。 四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同碱基存在。 引物设计原则 5.引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。 引物设计软件 Gene Runner 3.0 Oligo 4.0 引物分析软件 根据设计需要设置参数 对设计引物进行分析 酶切位点 引物二聚体 发夹结构 引物浓度 两条引物一般各在0.1~0.5μmol/L, 浓度太高会引起错配及非特异性产物扩增，增加形成引物二聚体的几率；太低则可能达不到扩增效果或产量太低。 引物合成的质量 引物一般经PAGE或HPLC纯化，以减少非特异扩增和信号强度. 冻干引物可以常温下运输，-20oC可以保存12~24个月，甚至更长，液体状态于 -20oC可以保存6个月或更长 （三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶最初从嗜热水生菌（中分离提取，现已有基因工程酶 (如AmpliTaqTM) 分子量94 kD，在70~75o C 时具有最高活性 Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性 Taq DNA聚合酶具有5’ 3’聚合酶和 5’ 3’外切酶活性，缺乏3’ 5’外切酶活性，因而无校正阅读功能 错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响 Taq DNA聚合酶在反应体系中的终浓度常为2~2.5U/100μL。酶量过少合成产物量低，酶量过高则非特异性产物随之增加。 （四）缓冲液 用于PCR的标准缓冲液含： 50 mM/L KCl 10 mM/L Tris-HCl (pH 8.3) 1.5 mM/L MgCl2 另加入保护Taq酶试剂: 牛血清白蛋白（100μg/ml） 或明胶 (0.01%) 或二硫苏糖醇(DTT)等 （五）M