2CTAB法植物总DNA提取.doc

2×CTAB法植物总DNA提取 1. 液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇 研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。 2. 加入500μl的2*CTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。 3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。 若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。 4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。 a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿 b.迅速进入下一步，以免各相混合 5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。 a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。 b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。 6. 在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。 6-1 在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2, 3M）l 70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。重复一遍。 8. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。 9. 在离心管中加入30-50μl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。 10.用琼脂糖凝胶检测结果。 11. -20℃—— -70℃低温保存。 去除总DNA中的 RNA污染 先做预扩增实验，若RNE污染无严重影响则舍去该步骤 A 1. 在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或者TE溶液调整总体积至200μl, 加入10μ RNase-A（10mg/ml）——溶解DNA—— -20℃—— -70℃低温保存。 B 直接加入10μ RNase-A（10mg/ml）H2O NaOH 去离子水 186.1g 约20克 定容至1L 高温高压灭菌，室温保存。 注：只有pH值接近8.0时，EDTA才能完全溶解。溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。 耗材准备： 需要灭菌者： 1.5ml离心管、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、 其他：卫生纸（吸水用）、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、离心管架子、离心管盒子、移液枪。