溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响.docVIP

溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响来源：中国论文下载中心???? - 作者：潘春燕，谢春英，王燮衡，王爱琴 【摘要】? 目的 了解用实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA拷贝数时，溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。 方法 采集30例乙型肝炎患者血液，分离血清，置于-20冰箱保存备用，并同时配制出含不同浓度Hb血清管。采用实时荧光定量PCR方法，检测含不同Hb浓度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷贝数，用配对t检验进行统计处理。结果 当标本中Hb浓度小于32 g/L时，Hb对检测血清乙型肝炎病毒DNA拷贝数无显著影响（P＞0.05）。结论 当Hb浓度较低时，Hb对血清乙型肝炎病毒DNA定量检测无显著影响，因此较低浓度溶血标本可以进行乙型肝炎病毒DNA的定量检测。 【关键词】? 乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR 　　血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判断乙型肝炎病毒在体内是否复制，患者传染性高低及选择治疗方案的重要指标。目前临床一般采用实时荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒DNA拷贝数进行定量检测。实时荧光定量PCR技术融汇了PCR技术的高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性等优点，通过直接检测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。但此技术可能与标本状态密切相关，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代谢产物可能与Taq酶相互作用，进而抑制Taq酶的活性，使PCR扩增效率明显降低，导致定量测定结果偏低［1］。在临床检验标本中，溶血标本较为常见，究竟溶血到何种程度会对乙型肝炎病毒DNA定量结果产生影响？本文将探讨不同程度溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。 　　对象与方法??? 　　1.对象? 我们收集了ALT＞40 U/L、HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBcAb阳性的乙型肝炎患者30例,其中男性17例，女性13例，年龄在18～53岁之间。??? 　　2.试剂? 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒（批号、乙型肝炎病毒DNA阳性标准品。??? 　　3.仪器? BECKMAN全自动血球计数仪（型号：Coulter Ac.Tdiffe）、Lightcycle荧光PCR扩增仪(罗氏公司)、高速低温离心机（Sigma公司）、干式恒温器（杭州蓝焰科技有限公司）、低温冰箱（SANYO公司）。??? 　　4. 方法??? 　　（1）模拟溶血标本的制备：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小时内离心分离血清，这种不含Hb的血清作为无Hb对照组，然后取每位患者600 μl血清及适量红细胞混合，置于-20冰箱保存备用。次日将含红细胞的血清管取出放于室温解冻，完全解冻后再将该管置于-20冷冻，如此反复冻融两次，使得RBC完全破裂，释放出Hb。在Coulter全自动血球计数仪测定每管红细胞裂解后的Hb浓度，再用每位患者的血清稀释，使得Hb终浓度为4 g/L、8 g/L、16 g/L、32 g/L，这些标本即为模拟溶血标本。??? 　　（2）乙型肝炎病毒DNA模板制备：取待测样本及阴、阳性对照（试剂盒备有）各100 μl,分别加入到0.5 ml的离心管中，再分别加入100 μl DNA提取液1，震荡混匀，13000 rpm离心10 min；吸弃上清液，再加入25 μl提取液2，震荡至沉淀完全散开，100干浴10 min；冷至室温后,13000 rpm离心10 min,保留上清液备用。??? 　　（3）PCR扩增：从试剂盒中取出乙型肝炎病毒DNA扩增反应液、Taq酶及UNG，室温融化后按规定比例混合均匀，根据试剂盒说明书配置反应液，分装于Roche毛细扩增管中，每次实验均设2管阴性对照，1管强阳性对照，1管临界阳性对照， 4管乙型肝炎病毒阳性工作标准品，其拷贝数分别为〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷贝/ml，将上述对照及样本各加2 μl于加好反应液的Roche毛细管中，短暂离心后上机扩增。对检测结果高于5.0×107拷贝/ml的标本进行稀释后再扩增，使其结果落在试剂盒检测线形范围内。??? 　　（4）核酸扩增与荧光数据采集：扩增条件设置为37孵育3分钟； 94变性1分钟；再进入40个循环，每一个循环包括92变性5秒，60退火及延伸30秒,在60时单点收集荧光信号；仪器检测通道选择F1通道。??? 　　（5）分析条件设定：选择F1通道，点击Quantification进入定量分析窗口，设定Analysis方式为proportional,选定Noise bank项，阈值选定为刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数据为准。??? 　　（6）数据分析：四个阳性标准品Ct值均须小于38.0，标准曲线的拟合度须小于-0.