美国药典溶出度4-法联合高效液相色谱分析低释放眼用植入制剂.doc

美国药典溶出度4法联合高效液相色谱分析低释放眼用植入制剂 David C. Browne and Shawn Kieselmann* Intertek, 291路东22号，塞勒姆工业园，白宫，美国新泽西州08888 目的 建立美国药典溶出度4法联合高效液相色谱分析低剂量眼用植入制剂的方法 背景 眼部植入制剂是一种体积小，以聚合物为基底的圆盘或者圆柱形的药用制剂，可改善药物进入眼睛后的治疗（1）。植入剂一些常见的类型包括巩膜外层植入剂，放置在眼睛的中纬线上；和玻璃体内植入剂，经外科手术放置在眼睛（2）玻璃体内。图1展示了眼睛的解剖图和各种植入剂的放置位置。眼植入物用于治疗各种疾病，如糖尿病视网膜病变和黄斑变性（1）。选择USP4法来测试该类产品的溶出度是由于该法采用层流的方式与体内条件具有良好的相关性，并且开环的配置方式提供的漏槽条件有利于难溶药物的溶出。 目标 该方法的建立主要有三个目标。第一，由于眼部植入制剂药物释放浓度低，需要优化色谱条件以获得定量限≤1/ml。其次，确定美国药典溶出度4法在测试过程中产生的干扰或吸附。最后，用美国药典溶出度4法联合高效液相色谱法获取溶出曲线。方法学 实验初期，选取Sotax CE 7 smart溶出仪（开环），pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为溶出介质进行实验。泵流速设置为最低流速（1.5ml/min），用以模拟体内条件，因为人体眼部玻璃体的流速大约为2μl/min（3）。一个剂量单位的药物置于铺有玻璃珠的22.6mm的流通池内。溶出液直接在线注入高效液相色谱仪进行分析，几天内每小时采样一次。不推荐使用收集器和自动进样器，因为待分析物与一些塑料会发生化学反应。 图1 眼部解剖图和局部给药的主要方法 为使溶出液直接注入高效液相色谱仪，溶出仪出口管路经缩小接头与一PEEK管相连，然后进入进样阀。在进样位置，溶出液流经阀门，进入废液接口。在载样位置，溶出液充满进样环。阀开关由电子控制。进样阀是连接到Perkin Elmer Series 200高效液相色谱系统（不包括进样器）。由于采用的是低流速1.5ml/min，进样环的后压很小，不会对系统的配件和连接部分造成损害。样品分析使用直径2.1SB -苯基色谱柱，进样量500μL以提高检测灵敏度。 HPLC流速为0.5ml/min，检测波长为280nm。优化的色谱条件可分析浓度低至1ng/ml的样品。 实验初期评估结果显示，待测物在pH值7.4的磷酸盐缓冲液中难溶，且产生降解。在该溶液中加0.1%的十二烷基硫酸钠（SDS）显著增加药物的溶解度和稳定性。实验表明，使用氯化钠代替SDS也可增加药物的溶解度和溶液稳定性。最终，选取按英国药典制备的pH值7.4磷酸缓冲盐生理盐水作为药物释放介质，既有生物意义，又有功效。 在溶出条件下测试空白溶媒，10ng/ml的标准溶液和定量限浓度的标准溶液1ng/ml， 24h，用于观测可能产生的干扰。图2是上述3种溶液的叠加图。 图2 空白溶媒，最低定量限和10ng/ml标准溶液HPLC叠加图 一旦仪器参数优化完成，将单个样品在溶出条件下测试14天。在第一个24小时内，采用自动程序进样器连接到液相色谱进样阀，每隔1h采样分析一次。从24到72小时，每两小时取样一次。72h后，每4小时采样一次。经2周测试，获取待分析物的溶出曲线。图3是14天内,以浓度ng/ml为单位的溶出率曲线图；图4显示以质量为单位的溶出率曲线图。 图4 待测成分的溶出曲线 结果 优化的条件下确保待测物具有足够的检测灵敏度，保留时间只需约4.3min。溶出无干扰。由于进样重复性较差，导致1ng/ml时回收率较高。这主要是自动进样器清洗和填充样品环时间不足所致。这导致响应值低而含量测定值偏高。然而，该数据表明在溶出试验过程没有发生吸附。随后的实验中，经设定进样器清洗程序，增加进样量至500μL，进样重复性得以提高，。14天的溶出曲线中，药物溶出率最初为17ng/min，在48h逐步下降到6ng/min 。14天的实验，溶出率稳定在3ng/min。溶出趋势呈规律性变化，由于植入剂的特殊设计，药物溶出度释放缓慢。 结论 研究开发了一种ng/ml水平眼部植入制剂溶出度测定方法。使用窄口径HPLC柱，进样量500μL。检测限小于1ng/ml，适于分析低浓度释放的眼部植入剂。Sotax CE 7 smart溶出度4法测定仪实现与HPLC的在线分析。在溶出度测试条件下，溶媒无干扰，1ng/ml水平无吸收。生成为期两周的单一眼植入制剂的溶出度曲线。因该方法与体内溶出相关，具有潜在的广阔的应用前景。 1. Lee, S. S.; Yuan, P.; Robinson, M. R. Ocular Implants for Drug Delivery. In Encyclope