通过获得链霉素抗性基因突变株筛选小诺霉素高产菌株的研究.pdfVIP

鼽届全国，微生物学教学和科研及成果产业化研讨会 嚣师范200犬3．1学1．8 通过获得链霉素抗性基因突变株筛选小诺霉素高产菌株研究‘ 涂国全”钟承赞2黄林‘ 黄珞珈2 翁娟2 (江西农业大学生物工程系南昌330045)。 (江西制药有限责任公司南昌330045)2 变剂EMS 3种不同诱变剂量对菌株的孢子进行诱变处理，诱变处理的孢子涂布在含链霉素致死浓度的改 良高氏平板上，获得大量的链霉索抗性基因突变株，然后从链霉素抗性基因突变株进一步筛选小诺霉素高 产菌株，获得小诺霉素菌株49-12-3菌株。在摇瓶条件下，其产小诺霉素生物活性单位比出发菌株49．124 的摇瓶发酵单位提高了40％以上。小诺霉索的组分比由出发菌株的C拍：Cl-的5：5提高到8：2。C，。有 效组分提高了30％；链霉素抗性基因突变与小诺霉素发酵单位突变之间，小诺霉素正突变率达到40％，负 突变率达26％，正突变大于负突变。 关键词： 降红小单孢菌，小诺霉索 链霉菌抗性基因突变筛选 中国分类号t 文章编号：0253．2654(2004)O-00．00 Q93文献标识码；A _l( 应用分子育种中关于抗生素产生菌抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁而 用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)进行诱变处理，使诱变的孢子DNA产生高频率突变，将突变 的孢子涂布在含链霉素致死浓度的培养基平板上进行培养，获得链霉素抗性基因(so-)突变株来筛 选小诺霉素高产菌株。本文报道这一初步研究结果。 l材料与方法 1．1材料 1．1．1菌种 降红小单孢菌(Micromonosporapurpura)49—124，指示菌：短小芽孢杆菌(Bucillus pumilus) 均为江西制药厂自行保存。 1．1．2培养基 斜面、平板和茄子瓶培养基：改良高氏培养基；生测培养基：牛肉青蛋白胨培养基、种子培养 基和摇瓶培养基均由江鹾制药厂自行设计筛选的培养基。 1．1．3链霉素 大连医药集团大连制药厂生产。 1．1．4诱变剂 甲基磺酸乙酯(EMS)：上海试剂一厂生产。 1．2方法 1．2．1链霉素抗性基因(Str)突变株的制备 (1)链霉素对49-124菌株孢子的致死浓度的测定：将制备好出发菌株的孢子悬液涂布在不同浓度 板上己长出菌落。而在后一个较高浓度上未长出菌落时，后一个浓度即为抗生素对出发菌株的孢子致死 4种不同处理剂量，在32C摇床上振荡3 h，用磷酸缓冲液稀释lO倍中止反应，诱变孢子稀释液分 别涂布在含致死浓度的链霉索和不含素的改良高氏培养基平板上，3TC培养9-10d，分别进行不同 处理的菌落计数，凡是在含链霉素致死浓度平板上长出来的菌落均为链霉素抗性基因(str)突变株。 1．2．2 8tr突变株高产菌株的筛选 net ’联系人Tel：《0791)3813466，E-maihmguequen@263 作者还有：江兵2 收稿日期：2003-07-22，惨回日期：2003-9-18 144 第九届全国微生物学教学和科研及成果产业化研讨会 筛入选菌株再进行二级摇瓶发酵复筛。 1．2．3小诺霉素生物检测法 二剂量法… 1．2．4小诺霉素组分比检测 采用硅胶薄板层析板检测，氯仿：甲醇：氨=1：1：2展层，碘显色。 2结果与分析 2．1链霉素抗性基因(Str)突变株的制备 2．1．1链霉素对49-1 2‘菌株孢子致死浓度测定结果 链霉素对49．124菌株孢子致死 表I链霉素对49．12-菌株孢子致死浓度测定 浓度测定结果见表1。 16 18 20 22 24 26 28