非感染性定量检测HIV诱导的细胞融合抑制活性方法的建立.pdfVIP

第二届全国病毒性肝炎和艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛 非感染性定量检测HIV诱导的细胞融合抑制活性 方法的建立 李珉珉夏承来毛芹超姜世勃刘叔文 自1983年HIV被分离发现以来，在不到25鹌h，可观察到合胞体的形成【5】。尽管这2种方 年的时间里，AIDS已导致2000万人死亡，目前仍法都能成功检测HIV诱导的细胞融合活性并用 有4000万人感染HIV，是第一大单一病因导致死于筛选HIV进人抑制剂，但都必须通过计数融合 亡的疾病，对人类的健康和经济社会的发展产生 细胞数或合胞体数目，主观性比较大。因此，继续 巨大的影响。 建立一个非感染性的且能客观定量检测HIV诱 25年来，已有近30种抗HIV药物及其组合导的细胞融合活性的方法对IⅡV进入抑制剂的 物被批准用于临床治疗AIDS。这些药物可分为筛选十分必要。为此．本研究用表达H1Vgpl20／ 逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及哪进入抑制 剂3大类。由于前两类药物易诱导瑚Ⅳ耐药性突 变，毒副作用大，目前H1V进入抑制剂已经成为CD．一LTR—B—gal细胞，建立以B半乳糖苷酶活性为 抗AIDS药物研究的热点【I】。已被批准的HIV进指标的定量检测HⅣ诱导的融合抑制活性的非 入抑制剂仅有2种，分别是融合抑制剂T-20【21和感染性方法。 CCtL5辅助受体拮抗剂Maraviroc【，】。相比于其他一、材料与方法 2类药物，HIV进人抑制剂还大有可为。 HIV通过其包膜糖蛋白gpl20／gp41介导病 ItesearehandReference 毒膜与靶细胞膜的融合，从而导致病毒基因组进 均来源于美国NIH加S 入靶细胞，完成病毒的复制或感染。因此。阻止 P汜ageurtt HIV病毒的进入，关键是阻止HIV 种细胞培养基、胎牛血清及胰蛋白酶／ED-I|A消化 gpl20／glMl诱 导的细胞．细胞融合。 red-D- HIV诱导的细胞．细胞融合活性检测，我们此 前建立了感染性和非感染性2种检测方法。感染 性方法使用荧光标记的I-19／HIV·1 gal)购白Sigma公司。AD6．Jl由CibaSpecialty IB与MT-2细胞 作为融合体系，其中前者为慢性感染HIV—l一。活 病毒的细胞株。2种细胞混合后4h，可观察到荧 光弥散现象，表明细胞发生了融合H】。而非感染 性的方法采用表达gpl20／gp41包膜蛋白的CH0-FMOC方法固相合成，然后通过高压液相色谱法 WT细胞与MT-2细胞建立融合体系，2者混合后(m忧)纯化获得。 优秀人才基金(Nam艏m53)；霍英东高等院校青年教师基金(m04s) fl=者单位：510630广娴，暨南大学附属第一医院牺床医学检验中心(李珉珉)；南方医科大学药学院(夏承来、毛芹超、姜世勃JⅡ叔文) 置信作者：羽叔文。电子信箱：lium*Ofumm．蛐 ．—134-—． 第二届全国病毒性肝炎和艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛 2细胞培养：IK2／3细胞的培养采用器加B半乳糖苷酶活性染色，可观察到二者共育能诱 导B半乳糖苷酶的表达，培养孔中可看到蓝色 10％血清的高糖DMEM培养基。HeLa—CD．-LTR- 2 C-418 mr,／d 斑点(圉I)。这表明两种细胞发生了细胞融合， B一础的培养采用舔加10％血清、0 和0 B)的DⅧM 1Ⅲ吕／ml潮霉索B(hygromycin 培养基。细胞的消化采用胰蛋白rcvEwra消化细胞中．与LTR结合，启动了口半乳糖苷酶的 裘选。 液。ID／HIVI胡吣采用添加体积分数为10％血 清的RPMI1640培养基。所有细