神经元差速贴壁纯化及影响因素分析.pdfVIP

172 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, February 2010, Vol. 24, No.2 · · 神经元差速贴壁纯化及影响因素分析 李骏 冯大雄 黄贻泽 叶飞 【摘  要】 目的 神经元纯化是各种神经细胞实验研究必不可少的实验步骤，但目前少见神经元纯化过程中各 种因素对神经轴突影响的实验报道。探讨简便有效的背根神经节神经元（dorsal root ganglion neurons，DRGn ）细胞纯化 方法和神经元培养体系内相关因素对β3-tubulin 阳性神经轴突生长状态的影响。  方法 取新生3 d 的SD 大鼠背根神 经节（dorsal root ganglion，DRG ）制成细胞悬液，根据玻片包被底物不同分为D- 多聚赖氨酸（poly-D-lysine，PDL ）组、 PDL/ 层粘连蛋白（Laminin ，LN ）组和Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）组，分别差速贴壁10、20 、30、40 、50、60、70、80、 90、100 min，倒置相差显微镜观察细胞贴壁情况，并采用免疫荧光染色观察各时间点DRGn 细胞和非DRGn 细胞贴壁数 量。将DRG 制备组织块培养72 h，采用完全随机设计的方法观察底物（PDL 、PDL/LN 、Col Ⅰ）、FBS （0、5%、10%）、五 氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu，0、20 、40 μmol/L ）和阿糖胞苷（cytrarabine，Ara-C ，0、10、20 μmol/L ）不同水平对DRG 整 节培养中β3-tubulin 阳性轴突长度和单位阳性轴突分支末梢数量的影响。  结果 倒置相差显微镜和倒置荧光显微镜观 察显示，细胞接种后即开始贴壁，贴壁10 min 后移除细胞悬液仍可见DRGn 细胞及非DRGn 细胞贴壁生长。PDL 组：贴 - + 壁 10、30 min ，神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase ，NSE ）阴性（NSE ）细胞数高于NSE 细胞数（P < 0.05 ）； 贴壁80、90、100 min，NSE+ 细胞数大于NSE- 细胞数（P < 0.05 ）。PDL/LN 组：贴壁10、20 、30、40 、50 min，NSE+ 细胞数 及NSE- 细胞数差异无统计学意义（P > 0.05 ）；贴壁60、70、80、90、100 min，NSE+ 细胞数大于NSE- 细胞数（P < 0.05 ）。 Col Ⅰ组：贴壁10 ～40 min ，NSE- 细胞数大于NSE+ 细胞数，但差异无统计学意义（P > 0.05 ）；贴壁70、80、90、100 min， NSE+ 细胞数大于NSE- 细胞数（P < 0.05 ）。DRG 整节培养72 h 后，底物水平为PDL/LN 时轴突生长分化最好，与PDL 水 平和Col Ⅰ水平比较差异有统计学意义（P < 0.05 ）     ；FBS 为5% 水平时β3-tubulin 单位阳性轴突分支末梢数最大（P < 0.05 ）， 但阳性轴突长度在0、5% 和 10% 3 个浓度水平比较差异无统计学意义（P > 0.05 ）；5-Fu 在0 浓度水平时β3-tubulin 单位 阳性轴突分支末梢数及阳性轴突长度均最大，与20 、40 μmol/L 浓度水平比较差异有统计学意义（P < 0.05 ）；Ara-C 在0 和 10 μmol/L 浓度水平的阳性轴突分支末梢数相同，均高于20 μmol/L 水平（P < 0.05 ）；而阳性轴突长度在10 μmol/L 水平时 最长，与0 和20 μmol/L