动物细胞培养技术.ppt

培养基必须具有下述基本条件： (1)营养物质： 培养基必须供给活细胞所需要的全部盐类 (2)缓冲能力： 培养基必须含有非毒性的缓冲液，而且pH值在pH 7.0—7.2之间。 (3)等渗性： 溶解于培养基的物质浓度产生的等渗性必须与细胞内的液体一致。 (4)无菌： 培养基不能有微生物，利用培养基繁殖起来的微生物会破坏培养的活细胞。 1．无菌实验室 2．超净台 3．培养箱和CO2培养箱 4．倒置显微镜 5．液氮罐 6．离心机、摇床 7．手术器械，灭菌、消毒等器具 所需设备和仪器等 细胞培养的一般过程 准备 取材 培养 观察检测 准备工作 器皿的清洗、干燥与消毒 培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌 无菌室或超净台的清洁与消毒 培养箱及其他仪器的检查与调试  常用培养器皿及清洗消毒  细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等。 学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。 玻璃器皿的清洗 1. 浸泡: 新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿应立即浸入清水中备刷洗。 2. 刷洗: 在洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。 3. 浸酸: 浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。 4. 冲洗: 每件器皿至少要反复“注水－倒空”10次以上，最后用重蒸水浸洗2-3次，晾干或烘干后包装备用。 橡胶制品清洗 新的橡胶制品：水中浸泡，2％NaOH煮沸10min，流水冲洗，烘干，1％稀盐酸浸泡30min，自来水洗，双蒸水洗3次，晾干或烘干后包装备用。 用过的橡胶制品：超声波洗涤机中超声洗涤30min，自来水洗，双蒸水洗3次，晾干或烘干后包装备用。 塑料制品的清洗 塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 清洗程序：清水清洗，烘干，2％NaOH浸泡过夜，流水冲洗，烘干，浸酸30min，,蒸馏水浸洗三次，双蒸水洗3次，晾干或烘干后包装备用。 包装 对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。 常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝箔、铝饭盒、较大培养皿等。 培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。 （一）物理消毒法 （二）化学消毒 （三）抗生素消毒 消毒和灭菌 消毒和灭菌 紫外线消毒: 通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物 高温湿热灭菌: 对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡 高温干热消毒: 主要用于灭菌玻璃器皿、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂） 过滤除菌：多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液 （一）物理消毒法 消毒和灭菌 （二）化学消毒：75％酒精，0.1％新洁而灭水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。 （三）抗生素消毒：主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。 无菌室或超净台的清洁与消毒 准备使用无菌室时，需将隔离区、无菌室及超净工作台的紫外灯开启照射30min，实验中要用到的所有器材均需同时接受紫外照射。 进入无菌室前，用洗手液仔细清洗双手，进入无菌室后戴上乳胶手套，用70％酒精进行消毒。 使用超净工作台前，先用70％酒精喷淋台面，用灭菌纱布进行擦拭，点燃酒精灯。 培养箱及其他仪器的检查与调试 CO2 钢瓶之CO2 压力  CO2 培养箱之CO2 浓度、温度 水盘是否有污染 培养 组织培养 细胞培养 器官培养 细胞培养 细胞计数及活力测定  培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力 。 用台盼兰染细胞，死细胞因细胞膜通透性改变，染料可大量进入而着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。 MTT法测细胞相对数和相对活力 细胞中的线粒体脱氢酶可使染料MTT转变为不溶性的紫色甲瓒颗粒，后者被酸性异丙酮溶解后所呈现的色度（OD表示）反映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。 普通染色观察 苏木精-伊红（HE) 和吉姆萨（Giemsa）染色是观察细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。 HE：细胞核紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。 Giemsa：细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈粉红色。 培养物的污染及防止 污染途径：