蔗糖梯度密度离心.docVIP

纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。其过程如下：1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。 问：我在做病毒纯化时，需先用超速离心，再用蔗糖密度梯度离心，求助高手用蔗糖密度梯度离心时的转速与超速离心时的转速有联系吗，是相等还是蔗糖密度梯度离心的转速要比超速离心的速度高？若为后者，那又若何决定蔗糖密度梯度离心时的转速？谢谢！ 答：1、病毒的纯化时，先用超速离心，你应该查一下资料，看在多大的转速时能够把病毒离心下来．那么你的这一步的转速应该至少不小于该转速，你这一步离心下来的沉淀中含有病毒和蛋白成分。 2、因此你的第二步工作就是要将病毒与其他的蛋白以及杂质分离开，密度梯度离心就可以达到该目的。这时你的离心速度要考虑病毒的大小和蔗糖的密度，使得病毒不能沉淀道管底又可与蛋白层分开。这也可能要具体问题具体分析。 问：谢谢主任的指点，我的病毒直径为100nm。查阅了有观资料，超速离心为21000rpm,45min，我用24000rpm2hr，我用20%-60%连续蔗糖密度梯度离心，该病毒在蔗糖中的浮密度为1.18mg/ml，请问我的糖密度梯度离心速度大概是多少？谢谢！ 答：我们实验室IBV （80-100nm）的纯化是：l 病毒纯化浓缩（方法一）1、冷冻之尿囊液解冻后，4℃，11000rpm离心20min。2、取上清，加入30%PEG6000（含7.85%NaCl）至沉淀出现（终浓度约为7~8%），4℃放置（或搅拌）过夜。3、4℃，19000rpm离心20min，弃上清，沉淀用适量TEN溶解。4、4℃，35000rpm离心3hrs，弃上清，沉淀用适量TEN溶解。5、4℃，33000rpm蔗糖密度梯度离心2.5hrs（蔗糖梯度：20%, 30%, 40%, 50%, 60%）。6、抽取40%蔗糖带（含IBV病毒），-40℃保存。 你的我想也差不多吧！ 答：你的病毒在蔗糖中的浮密度为1.18mg/ml，如果经过足够长的时间的离心话，那么大概就沉淀在40%-50%靠近40%的这已层中。（40%的蔗糖25度时的浓度为1.176，50%的蔗糖25度时的浓度为1.230）现在必须知道病毒的沉降系数才能算出她你所需要的时间。单纯回答你的离心速度时豪无意义的，必须与时间结合来说明你的离心。一定的速度加上一定的时间才能把病毒分开。 注意事项 离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不 同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条 界面清楚的不连续区带。再通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带 中的颗粒分开收集，得到所需的物质。 1 、梯度介质应具备足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围。 2 、梯度介质不会与样品中的组分发生反应。 3 、梯度介质也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。 4 、若离心时间过长由于颗粒的扩散作用，会使区带越来越宽。为此，应 适当增大离心力、缩短离心时间，可以减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。 STE 缓冲液（ Sodium-Tris-EDTA ， STE ） ? 10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) ? 0.1 mol/L NaCl ? 1 mmol/L EDTA (pH 8.0) 在 15 psi (1.05 kg/cm 2 ) 高压下蒸汽灭菌 15 min 。将灭菌溶液与 4 ° C 保存。