植物生长激素免疫传感器地研究.pdfVIP

植物生长激素免疫传感器的研究 李劲，吴朝阳，沈国励’，俞汝勤 (湖南大学化学计量学与化学生物传感技术教育部重点实验室，长沙．410082) 9一吲哚乙酸(1从1是一种重墨的植物生长激素，它在植物生长发育过程中的各个阶 段起着重耍的调节作用，近年来的研究表明植物的抗／感病反应也与植物激素有着密切 的联系11．2】。植物激素在植物体内含量很低，而且很不稳定，容易被光解、热解和氧 化．B一吲哚乙酸常用的测定方法有气相色谱(Gc)，商效液相色谱(HPLC)、酶联免疫 (ELISA)圳、及放射免疫IPdA)等。这些方法中，有的操作繁琐、测定周期长，有的精确 度和灵敏度欠佳。由于生物学在许多重要领域研究中要求简便、快速和准确地测定植 物激素．因此上述方法都存在某些不足。 本文采用新的成膜技术和新的蛋白质固定方法l，通过免疫学实验制备了特定抗 体，设计了一种压电型免疫传感器，在测定低浓度的13一吲哚乙酸时取待了良好的效 果。 一、抗体09G)的制备： 1AA是一种半抗原，用EDC法将其与载体牛血清白蛋白连接成为抗体毋SA． IAA)I”．将抗体注射到新西兰小白兔体内进行免疫，背部注射每周一次，四周后取全血 得到抗血清．血清经饱和的(NH)：S饥沉淀、4C条件下用透析袋透析分离提纯得到抗 体抗【AA免疫球蛋白IgGf“rl。这种抗体既可以结合抗原BSA-IAA，又可以结合半抗原 ‘IAA。 二、晶体的包被：r AT．切型石英晶体谐振器，谐振频率为9MHz双面镀金屯极，晶片直径12ram，电 极直径6ram。将其一面用O型橡胶和塑料片封闭，形成一个空气室，从而可在液相中 的浓H，SO。的混合液，混合液的体积比为l：3)洗涤三次，每次三分钟。用金黄色葡萄 球菌蛋白A涂层，蛋白A与金有很强的吸附作用，可在金电极表面形成一层单分子膜 到石英晶体上(B．”。将5u1蛋白A涂于金电极表面，在30℃温育30min，用pH e簧层，温 7．4，25ram的PBS和双蒸水轻轻清洗后吹干．再用209I的l：10稀释度的IgG 闭晶体电极上非特异性吸附位点。完成晶体的包被。 三、实验步骤及结果： 根据半抗原和抗原在晶体上的竞争反应进行未知样的测定p“．实验表明传感器在 m为7．o墙．0，温度30--40C条件下性能很好．40min左右可完成铡定。 1．测定反应体系无待测物IAA时频率变化|¨R。在恒温反应池中加入3ml反应 液，将石英晶体插入其中均匀搅拌，lO30min后传感器频率趋于稳定，在15s内加入 抗体∞SA-IAA)频率开始降低30s后记下此时的频率为F。．40min后记下诧时的频率为 F：，传感器频率变化为△F。=F，．F，。 ’2．按同样的方法测定反应体系有IAA时的频率降AF；。半抗原IAA也能与晶体上的 IgG结合，由于它的分子量小不能改变传感器的频率，但是IAA在晶体上的结合将降 127 低抗体(BSA-IAA)与晶体的结合，抗体与晶体结合减少将使得传感器的频率变化减少。 即半抗原对抗原产生竞争抑制率作用，抑制率为： 1％：—AFF0-AFz (1、 厶F I％与IAA的浓度相关．不同标准浓度(C．)的1AA对应出不同的AE，根据(1)式各个 浓度下的L％，作出C。一I，％的标准曲线(图略)。 3测定未知样中LAA的浓度。先测出反应体系中加入未知样后的△Fx．由(1)式求出 k％，再从标准曲线求出1AA的浓度。 我们设计的这种压电免疫传感器，通过抗原、抗体的专一性反应产生信号的输出， 降低了石英晶体上非特异性吸附对传感器信号产生的影响，大大提高了测定B一吲哚乙 酸的选择性，并能在液相中对微量的IAA进行快速准确的测定。测定时操作方便，仪 器灵敏度高、性能稳定，样品处理简单．是一种可替代其它的IAA测定方法的可靠的 传感器。它的研究也将为其他植物激素传感器的研制提供新的思路和方法。 参考文献： [1】李宗蓬，植物激素及其免疫检测技术1996，南京：江苏科学技术出版社． 【2】章元